黃獨素B致小鼠急性肝損傷的代謝組學研究

巫圣乾 張璐 龔夢鵑 王淑美 梁生旺 鄒忠杰

摘 要 目的：從代謝層面探索黃獨素B致小鼠急性肝損傷的潛在生物標志物，研究其肝毒性作用機制。方法：將24只小鼠隨機分成正常組（0.5%羧甲基纖維素鈉溶液）和黃獨素B組（200 mg/kg），每組12只。一次性灌胃給予相應藥物24 h后，檢測小鼠血清中丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）水平和肝組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平；采用蘇木精-伊紅染色法觀察肝組織病理學變化；采用核磁共振氫譜（1H-NMR）檢測尿液和肝組織中的代謝產物水平，并采用正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）篩選黃獨素B肝毒性的潛在生物標志物。結果：與正常組比較，黃獨素B組小鼠血清中ALT、AST水平均顯著上升，肝組織中MDA水平顯著上升、SOD水平顯著下降（P<0.05）；肝組織細胞受損，出現明顯病理性改變；尿液和肝組織中代謝產物水平發生顯著改變，各篩選得到3種和6種與肝損傷相關的潛在生物標志物（P<0.05），分別為α-酮戊二酸、二甲胺、氧化三甲胺（尿液）和谷胱甘肽、牛磺酸、肌苷、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸（肝組織）。結論：黃獨素B主要是通過自由基氧化作用損傷肝細胞，其對機體三羧酸循環、氨基酸代謝、腸道菌群產生影響可能是其肝毒性的作用機制。

關鍵詞 黃獨素B；急性肝損傷；肝毒性；代謝組學；核磁共振氫譜；小鼠

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）22-3046-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.05

ABSTRACT OBJECTIVE： To explore potential biomarkers of acute hepatic injury induced by diosbulbin B and study its hepatotoxicity mechanism from metabolic aspect. METHODS： Totally 24 mice were randomly divided into normal group （0.5% sodium carboxymethylcellulose solution） and diosbulbin B group （200 mg/kg）， with 12 mice in each group. They were given relevant medicine intragastrically； 24 h later， the levels of ALT， AST in serum and MDA， SOD in liver tissue were determined. HE staining was used to observe the histopathological changes of liver tissue. The levels of metabolism products in urine and liver tissue were determined by 1H-NMR. The potential biomarkers of diosbulbin B hepatotoxicity were screened by OPLS-DA. RESULTS： Compared with normal group， the levels of ALT and AST in serum， the level of MDA in liver tissue were increased significantly in diosbulbin B group， while the level of SOD in liver tissue was decreased （P<0.05）. The liver cells were damaged，with marked pathological changes. The levels of metabolic products were significantly changed in urine and liver tissue. Three and six potential biomarkers related to acute hepatic injury were obtained （P<0.05）， i.e. α-ketopglutaric acid， dimethylamine， trimethylamine oxide （urine） and glutathione， taurine， inosine， tyrosine， phenylalanine， histidine （liver tissue）. CONCLUSIONS： The hepatic injury induced by diosbulbin B are caused by free radical oxidation. The mechanism of hepatotoxicity may be the effect of diosbulbin B on tricarboxylic acid cycle， amino acid metabolism and intestinal flora.

KEYWORDS Diosbulbin B；Acute hepatic injury；Hepatotoxicity； Metabonomics； 1H-NMR； Mice

黃藥子為薯蕷科薯蕷屬植物黃獨（Dioscorea bulbifera L.）的干燥塊莖，其藥性苦寒，歸脾、肝經，具有消痰散結、清熱解毒之功效[1]。研究表明，黃藥子具有抗癌、抗菌、止痛、抗炎等藥理作用[2]，但同時具有肝毒性，可引起小鼠肝損傷[3]。黃獨素B（Diosbulbin B）屬于二萜內酯類化合物，為黃藥子的主要毒性成分[4-5]，深入研究其肝毒性對黃藥子的開發和臨床應用具有重要意義。

代謝組學是20世紀 90 年代中期發展起來的一門新興學科，其是通過分析生物體因病理、生理刺激或基因改變所致的代謝產物的變化來研究生物體系代謝途徑的一種技術[6]。核磁共振氫譜（1H-NMR）代謝組學技術是代謝組學研究中最常用的一種技術，具有不破壞樣本、分辨率高及重現性佳等的優點[7]，適用于中藥等復雜成分的分析。已有研究采用代謝組學技術分析了黃藥子乙醇提取物致大鼠肝損傷的生物標志物[8]，并通過膽汁酸代謝網絡分析發現黃藥子和黃獨素B誘導肝損傷的作用機制可能與膽汁酸及脂肪酸代謝密切相關[9-10]。本研究利用1H-NMR技術對黃獨素B致小鼠急性肝損傷后尿液和肝組織的代謝產物變化進行研究，鑒定相關潛在的生物標志物，以明確黃獨素B肝損傷作用的代謝通路，為揭示其肝毒性的分子機制奠定實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

AVANCE Ⅲ 500 MHz型全數字化超導核磁共振譜儀（瑞士Bruker公司）；ELX-808型酶標儀（美國BioTek公司）；1-14型低溫離心機（德國Sigma公司）；Vectra智能切片分析系統（美國PerkinElmer公司）。

1.2 藥品與試劑

黃獨素B單體化合物（廣東雋沐生物科技有限公司，批號：wkq16120204，純度：99.47%）；丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20171022、20171021、20171024、2017102）；疊氮化鈉（NaN3，天津市福晨化學試劑廠）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，上海滬試實驗器材股份有限公司）；氘水（D2O）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）、3-（三甲基甲硅烷基）氘代丙酸鈉（TSP-d4）（美國Sigma公司）；乙腈為色譜純，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級昆明種小鼠，雄性，體質量20～24 g，購于南方醫科大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SYXK（粵）2016-0167。動物均在室溫（20±2）℃、相對濕度50%的屏障環境中適應性飼養3 d后再進行后續實驗。

2 方法

2.1 分組與給藥

取24只小鼠，按體質量隨機分為正常組和黃獨素B組，每組12只。參照文獻[4]方法并結合預實驗結果，黃獨素B組小鼠一次性灌胃黃獨素B混懸液（200 mg/kg，給藥前以0.5% CMC-Na溶液制成10 mg/mL的混懸液）；正常組小鼠灌胃等體積0.5% CMC-Na溶液。

2.2 生物樣本的取樣

給藥24 h后，選取正常組和黃獨素B組小鼠各6只，于眼眶后靜脈叢取血并置于離心管，室溫下凝固后，在4 ℃條件下以4 000 r/min離心10 min，取上層血清，進行血清實驗室指標檢測；然后頸椎脫臼處死小鼠，剖取肝臟，進行肝組織實驗室指標檢測和病理組織學檢查。兩組其余6只小鼠于給藥后分別放置于代謝籠內，收集24 h尿液（集尿器置于冰上，并加入1% NaN3溶液作為防腐劑），然后頸椎脫臼處死小鼠并剖取肝臟，進行尿液和肝組織代謝組學分析。

2.3 血清和肝組織實驗室指標檢測

取“2.2”項下小鼠血清，檢測ALT、AST水平；取“2.2”項下小鼠部分肝組織制成勻漿，在4 ℃條件下以3 500 r/min離心10 min，取上清，檢測MDA、SOD水平。試驗嚴格按照相應試劑盒說明書進行操作。

2.4 肝組織病理學觀察

取“2.2”項下小鼠另外部分肝組織，以10%福爾馬林溶液固定12 h以上，依次進行乙醇梯度脫水、透明、浸蠟包埋，切片（5 μm）并脫蠟后進行蘇木精-伊紅染色法（HE）染色。置于光學顯微鏡下觀察小鼠肝組織的病理學變化情況。

2.5 尿液和肝組織代謝組學分析

2.5.1 尿液樣本處理 取“2.2”項下小鼠尿液樣本400 μL，加入PBS 200 μL后靜置20 min，在4 ℃條件下以 3 500 r/min離心10 min。取上清液500 μL加至NMR樣品管中，再加入含0.05% TSP-d4的D2O 50 μL，振蕩混勻，轉移至核磁管中待測。

2.5.2 肝臟樣本處理 取“2.2”項下小鼠肝臟小葉樣本，稱質量后按5 mL/g的量加入50%乙腈制成勻漿，在4 ℃條件下以12 000 r/min離心10 min。取上清液750 μL凍干后，加入PBS 450 μL和含0.05% TSP-d4的D2O 450 μL溶解，在4 ℃條件下以12 000 r/min離心10 min，取上清液550 μL轉移至核磁管中待測。

2.5.3 1H-NMR數據采集及分析 設置實驗溫度為298 K，采用預飽和的1D NOESY脈沖序列壓制水峰，采樣時間為3.28 s，弛豫延遲時間為3.0 s；設置樣本譜寬為10 kHz，采樣點數為64 K，采集次數為128次；采用線寬為0.3 Hz的指數窗函數進行傅里葉變換。采用MestReNova 6.1軟件對所獲1H-NMR圖譜進行手動相位和基線校正后，參照TSP-d4（δ0）對圖譜的化學位移進行定標。在δ0.5～9.5區域按δ0.01等間隔分段積分，對于尿液和肝組織樣本，分別將區域δ4.47～6.01和δ4.68～5.20設為0積分段，然后采用Excel 2010軟件對圖譜各分段積分值進行歸一化處理。將所得數據乘以10 000后導入SIMCA-P 12.0軟件，經Pareto標度化預處理后，進行正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）。

2.5.4 模型可靠性驗證及代謝物鑒定 采用7倍交叉驗證法對OPLS-DA 模型的可靠性進行驗證[11]，得到OPLS- DA模型的主要參數。尿液：R2X（cum）=0.70，R2Y（cum）=0.90，Q2（cum）=0.81；肝組織：R2X（cum）=0.87，R2Y（cum）=0.83，Q2（cum）=0.89。從上述參數可以看出本模型具有較高的可靠性。然后，根據化學位移值、峰的裂分、耦合常數及相關文獻報道[12-13]對代謝物譜峰進行鑒定。

2.6 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。實驗數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠血清和肝組織實驗室指標檢測結果

與正常組比較，黃獨素B組小鼠血清中ALT、AST水平和肝組織中MDA水平均顯著上升，肝組織中SOD水平顯著下降，差異均有統計學意義（P<0.05），表明黃獨素B可造成小鼠肝組織損傷。兩組小鼠血清中ALT、AST和肝組織中MDA、SOD水平檢測結果見表1。

3.2 小鼠肝組織病理學觀察結果

正常組小鼠肝組織細胞邊界清晰、排列整齊、形態正常，未見組織病理學異常；黃獨素B組小鼠肝組織細胞出現少量脂肪樣變性，部分細胞出現水腫，表明黃獨素B對小鼠肝組織細胞造成了損傷，引起了明顯的肝組織病理性改變。兩組小鼠肝組織病理學顯微圖見圖 1。

3.3 小鼠尿液和肝組織代謝組學分析結果

小鼠尿液和肝組織的1H-NMR圖譜見圖2、圖3；正常組與黃獨素B組小鼠代謝物差異的OPLS-DA分析結果見圖4。由圖4可見，黃獨素B組與正常組樣本點在PC1維上可以完全分開，表明黃獨素B引起小鼠肝損傷后使機體的代謝表型發生了明顯變化。

選取OPLS-DA 模型中變量重要性投影參數VIP>1的差異變量，再用t檢驗對篩選到的差異變量在黃獨素B組與正常組之間進行驗證，以變量差異的P<0.05判定其為潛在的生物標志物[14]。按照上述原則，最終在尿液和肝組織中分別篩選得到α-酮戊二酸等3種和谷胱甘肽等6種代謝物的峰面積差異具有統計學意義（P<0.05），判定其為黃獨素B肝毒性相關的潛在生物標志物，詳見表2。

4 討論

4.1 黃獨素B造成肝損傷的作用機制

ALT、AST在正常狀態時即存在于肝細胞中，兩者水平明顯上升則表明肝細胞受到了損傷[15]；MDA為機體內脂質過氧化反應的重要產物，其水平的高低可間接反映機體細胞受自由基攻擊后的損傷程度；SOD是生物體內重要的抗氧化酶，是生物體內清除自由基的主要物質，其可對抗與阻斷自由基對細胞造成的損害并及時修復受損細胞[16]。本研究結果顯示，與正常組比較，黃獨素B組小鼠血清中ALT、AST水平和肝組織中MDA水平均顯著上升，肝組織中SOD水平顯著下降，表明黃獨素B可通過自由基氧化作用而損傷肝細胞。

肝細胞脂肪樣變性的主要原因為脂質蛋白合成障礙、中性脂肪合成過多、細胞發生水腫[17-18]。本研究結果顯示，黃獨素B組小鼠肝組織細胞發生了脂肪樣變性及水腫。其原因可能是黃獨素B引起小鼠肝細胞脂質代謝異常，并通過自由基氧化作用損傷細胞膜，造成細胞膜通透性增加，從而使其發生水腫。

4.2 黃獨素B引發肝損傷后機體的多參數代謝應答

谷胱甘肽能激活各種酶，在三羧酸循環中起到重要作用，能促進脂肪、蛋白質、糖代謝，使機體獲得高能量，進而影響細胞的代謝過程[19]，改善中毒性肝炎、感染性肝炎的癥狀。肌苷為腺嘌呤的前體，能活化丙酮酸氧化酶系，提高輔酶A的活性，而輔酶A與人體能量代謝、物質合成、免疫系統的激活都密切相關，其可使組織細胞在低能量、缺氧狀態下繼續順利進行代謝[20]。本研究結果顯示，黃獨素B組小鼠肝組織中谷胱甘肽和肌苷水平均顯著下降，說明其體內糖、蛋白質等的代謝受到影響，能量代謝減少，提示小鼠發生肝損傷使得肝組織能量代謝水平下降。

牛磺酸具有滲透調節、抗氧化、穩定細胞膜等生理作用[21]，可通過減弱氧化應激和抑制脂質過氧化來緩解長期飲酒造成的肝損傷[22]。本研究結果顯示，黃獨素B組小鼠肝組織中牛磺酸水平顯著降低，表明黃獨素B可能通過氧化應激與脂質過氧化兩方面造成肝損傷。另外，牛磺酸可與游離膽汁酸結合形成結合型膽汁酸，飲食中的脂肪酸又能改變膽汁酸成分[8]，而膽汁酸又可對腸道菌群產生影響。因此，牛磺酸和膽汁酸均與腸道菌群有較密切關系，其水平變化提示黃獨素B的肝毒性可能與腸道菌群改變有關。

α-酮戊二酸是三羧酸循環的重要中間產物，連接著細胞內的碳-氮代謝，參與體內多種物質的合成代謝[23]；酪氨酸、苯丙氨酸代謝通路主要在肝組織中進行，其水平的變化與肝功能密切相關[24]；氧化三甲胺與二甲胺為腸道菌群代謝活動的產物，膽堿在腸道內經由腸道微生物作用生成三甲胺，進而被代謝成氧化三甲胺與二甲胺[25]。本研究結果顯示，黃獨素B組小鼠體內酪氨酸、苯丙氨酸、α-酮戊二酸水平均異常升高，提示肝細胞內線粒體活性下降，相關代謝物堆積，最終導致能量合成減少、細胞受損；同時，氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸）水平顯著上升，提示氧化應激可能造成了肝組織氨基酸代謝紊亂及蛋白質變性降解[26]；而氧化三甲胺與二甲胺水平的異常變化則說明黃獨素B可能引起小鼠腸道菌群生態的破壞，導致腸道菌群功能失常。本研究結果顯示，黃獨素B能分別使小鼠尿液中3種和肝組織中6種與急性肝損傷相關的潛在生物標志物水平發生顯著改變，表明其造成小鼠肝損傷可能與機體能量和物質代謝、氨基酸代謝及氧化應激有關。

綜上所述，黃獨素B主要是通過自由基氧化作用損傷肝細胞，其肝毒性的可能機制為其對機體三羧酸循環、氨基酸代謝、腸道菌群等產生影響。

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（收稿日期：2018-05-06 修回日期：2018-09-30）

（編輯：段思怡）