化州柚花揮發油的GC—MS分析及其對肺癌細胞A549增殖、遷移的影響研究

李武國 蘇喬 魏潔書 朱燁妍 劉翠婷 李雯雯 趙廣銀 黃浩機 詹若挺

摘 要 目的：提取化州柚花揮發油，鑒定其成分，并評價其對肺癌細胞A549增殖、遷移的體外抑制作用。方法：采用水蒸氣蒸餾法提取化州柚花揮發油；采用氣質聯用法（GC-MS）分析其化學組成，以峰面積歸一化法計算各組分的相對百分含量；采用MTT法檢測其對肺癌細胞A549增殖的抑制作用，計算細胞相對活力和增殖抑制率；采用細胞劃痕實驗評價其對肺癌細胞A549遷移能力的影響，計算相對遷移面積和遷移抑制率。結果：從100 g化州柚花中提取得到揮發油0.7 g，得率為0.7%。共從中分離得到了46個組分，鑒定了其中35個組分，占總峰面積的96.95%；相對百分含量較高的化合物包括D-檸檬烯（28.43%）、γ-萜品烯（20.74%）、β-月桂烯（11.97%）、芳樟醇（7.41%）等。與空白對照組比較，120 mg/L化州柚花揮發油可顯著降低肺癌細胞A549的相對活力（P<0.05），增殖抑制率上升至21.72%；而1、5、10、20、40、60、80、100 mg/L化州柚花揮發油對肺癌細胞A549的相對活力均無顯著影響（P>0.05）。作用24、48 h時，60、120 mg/L化州柚花揮發油可顯著縮小肺癌細胞A549的相對遷移面積（P<0.05），遷移抑制率分別為132.46%、125.08%（24 h）和124.54%、124.66%（48 h）；而30 mg/L化州柚花揮發油對肺癌細胞A549的相對遷移面積均無顯著影響（P>0.05）。結論：GC-MS法可用于鑒定化州柚花揮發油的化學組成?；蓁只〒]發油以D-檸檬烯、γ-萜品烯、β-月桂烯等成分為主，對肺癌細胞A549的增殖、遷移能力具有一定的體外抑制作用。

關鍵詞 化州柚花；揮發油；氣質聯用法；增殖；遷移；肺癌細胞A549；體外抑制作用

中圖分類號 R284.1；R734.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）22-3093-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.15

ABSTRACT OBJECTIVE： To extract and identify the volatile oil from the flowers of Citrus grandis， and evaluate inhibitory effects of it on the proliferation and migration of lung cancer A549 cells in vitro. METHODS： The volatile oil was extracted from the flowers of C. grandis by steam distillation. The chemical constituents were analyzed by GC-MS. Relative percentage of each component was calculated by peak area normalization. Inhibitory effect of volatile oil on the proliferation of lung cancer A549 cells was detected by MTT assay， and the relative activity and proliferation inhibitory rate were calculated. Inhibitory effect of volatile oil on the migration of lung cancer A549 cells was evaluated by cell scratch test， and the relative migration area and migration inhibitory rate were calculated. RESULTS： Totally 0.7 g volatile oil was obtained from 100 g flowers of C. grandis with a yield of 0.7%. A total of 46 chemical components were isolated from the volatile oil， among which there were 35 compounds identified， accounting for 96.95% of the total peak area. The compounds with relatively higher percentage content included D-limonene （28.43%）， γ-terpinene （20.74%）， β-myrcene （11.97%） and linalool （7.41%）， etc. Compared with blank control group， 120 mg/L volatile oil from the flowers of C. grandis could significantly reduce the relative activity of lung cancer A549 cells （P<0.05）， and the proliferation inhibitory rate increased to 21.72%. The volatile oil from the flowers of C. grandis had no obvious inhibitory effects on the relative activity of lung cancer A549 cells at the concentration of 1， 5， 10， 20， 40， 60， 80， 100 mg/L （P>0.05）. After treated for 24， 48 h， the volatile oil from the flowers of C. grandis could significantly reduce the relative migration area of lung cancer A549 cells at the concentration of 60， 120 mg/L （P<0.05）； and the migration inhibitory rate were 132.46%， 125.08% （24 h） and 124.54%， 124.66% （48 h）， respectively. But 30 mg/L volatile oil from the flowers of C. grandis had no obvious inhibitory effects on the relative migration area of lung cancer A549 cells （P>0.05）. CONCLUSIONS： GC-MS can be used for identifying chemical compositions of volatile oil from the flowers of C. grandis. Volatile oil from the flowers of C. grandis are mainly D-limonene， γ-terpinene， β-myrcene， etc.， which can inhibit the the proliferation and migration of lung cancer A549 cells.

KEYWORDS Citrus grandis； Volatile oil； GC-MS； Proliferation； Migration； Lung cancer A549 cells； Inhibitory effect in vitro

化州柚花為蕓香科植物化州柚（Citrus grandis ‘tomentosa）的花。未成熟或近成熟化州柚的干燥外層果皮經加工后可制成廣東省十大道地藥材之一的化橘紅，習稱“毛橘紅”，歸肺、脾經，具有理氣寬中、燥濕化痰之功效，可用于治療咳嗽痰多、食積傷酒、嘔惡痞悶[1]。而化州柚花在化州當地也被制成理氣化痰的花茶作保健用[2]。目前，化州柚花中已發現的藥用化學成分主要包括揮發油、黃酮類、檸檬苦素類和香豆素類等[2-5]，其中揮發油主要成分為萜類。在已報道的化州柚花揮發油成分中，D-檸檬烯能通過促進自噬而誘導細胞凋亡，從而發揮對肺癌細胞A549、H1299的抑制作用[6]；芳樟醇可通過誘導細胞凋亡和/或氧化應激反應而對白血病[7]、胃癌、肺癌、皮膚癌[8]、肝癌[9]、直腸癌[10]等腫瘤產生抑制作用；金合歡醇能夠通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路誘導前列腺癌細胞DU14的凋亡[11]。由此可見，化州柚花揮發油單一有效成分對多種腫瘤細胞均具有較強的體外抑制活性。因此歸肺經的化州柚花，其揮發油整體是否具有體外抗肺癌活性值得探究。為此，本研究采用氣質聯用法（GC-MS）對化州柚花揮發油成分進行分析，并初步探討其對肺癌細胞A549增殖、遷移的體外抑制作用，以期為化州柚花的開發利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Class Ⅱ BSC型生物安全柜（新加坡Esco公司）；Biofuge Primo R型離心機、HERAcell 150i型細胞培養箱、Multiskan FC型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；SUNNY-XD30型顯微鏡[舜宇光學科技（集團）有限公司]；ZW-A型微量振蕩器（江蘇科析儀器有限公司）；Voyager型GC-MS儀，配有標準質譜圖庫NIST 11、TG-WaxMS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）（美國Finnigan公司）；98-Ⅰ-B型電子調溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；1 000 mL揮發油提取器（北京博美華科玻璃有限公司）。

1.2 藥材與試劑

化州柚花由本課題組于2017年4月采摘自廣東省化州市文樓鎮某化州柚種植場，經廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心詹若挺研究員鑒定為蕓香科柑橘屬植物化州柚（C. grandis ‘tomentosa）的花，陰干后備用；其樣本（編號：YY10101）保存于中山大學附屬第一醫院動物實驗中心。

胎牛血清（FBS，批號：42G5550K）、DMEM培養基（批號：8117108）、青鏈霉素（批號：1881450）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（0.25% Trypsin-EDTA）溶液（批號：1676922）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，批號：8117157）均購于美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT，批號：3580GR001，臨用前以PBS配制成質量濃度為5 g/L的溶液）、二甲基亞砜（DMSO，細胞培養級，批號：EZ1609C224）均購于德國BioFroxx公司；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 細胞

人肺癌細胞A549由廣東省實驗動物監測所李文德研究員贈送。

2 方法

2.1 化州柚花揮發油的提取

采用水蒸氣蒸餾法提取。稱取干燥化州柚花100 g，置于揮發油提取器中，加6倍質量的蒸餾水浸泡1 h后，蒸餾提取6 h，收集揮發油，經無水硫酸鈉干燥后，稱重，計算得率[得率（%）=揮發油質量/化州柚花質量×100%]。

2.2 化州柚花揮發油樣品的處理

取上述揮發油樣品適量，用乙醚稀釋，配制成質量濃度為50 g/L（以揮發油質量計）的溶液，用無水硫酸鈉干燥后，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液適量進行GC-MS法分析。

取上述揮發油樣品適量，用DMSO稀釋，配制成質量濃度為30 g/L（以揮發油質量計）的溶液，作為體外試驗的樣品貯備液。

2.3 GC-MS條件

2.3.1 GC條件 色譜柱：TG-WaxMS石英毛細管柱；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持3 min，以6 ℃/min升至130 ℃，以2 ℃/min升至210 ℃，以20 ℃/min升至300 ℃；進樣口溫度：270 ℃；載氣：高純氦氣；載氣流量：1 mL/min（恒流模式）；分流比：20 ∶ 1；進樣量：0.1 μL。

2.3.2 MS條件 電離源：電子轟擊（EI）電離源；電子轟擊能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；掃描方式：全譜圖掃描（Full scan）；掃描速度：2 200.19 amu/s；掃描范圍：m/z 33～450；溶劑延遲時間：3 min。

2.4 化州柚花揮發油成分相對含量的計算

使用標準質譜圖庫NIST 11進行檢索匹配，通過人工質譜圖解析并確證各化學成分的結構，采用峰面積歸一化法計算其相對百分含量。

2.5 化州柚花揮發油對肺癌細胞A549增殖能力的影響

采用MTT法[12]檢測化州柚花揮發油對肺癌細胞A549增殖能力的影響。體外培養肺癌細胞A549，待其生長至約80%融合時，收集對數生長期細胞適量，經0.25% Trypsin-EDTA溶液消化后計數，按3 000個/孔接種至96孔板中，置于5% CO2、37 ℃細胞培養箱中孵育24 h后，將細胞隨機分為空白對照組和化州柚花揮發油不同劑量組，每組設置3個復孔。吸棄各孔上清液，空白對照組加入含0.4% DMSO和10% FBS的DMEM培養基100 μL，各給藥組分別加入含10% FBS和不同質量濃度（1、5、10、20、40、60、80、100、120 mg/L，以揮發油質量計；取“2.2”項下樣品貯備液各適量至DMEM培養基中即得，劑量設置參考文獻[13-14]）化州柚花揮發油的DMEM培養基各100 μL，于5% CO2、37 ℃細胞培養箱中孵育24 h，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，于5% CO2、37 ℃細胞培養箱中繼續孵育4 h，吸棄各孔上清液，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，使用酶標儀于490 nm波長處測定各孔的光密度（OD）值，計算細胞相對活力（細胞相對活力=各組平均OD值/空白對照組平均OD值），并依據細胞相對活力計算增殖抑制率[增殖抑制率（%）=（1-各組平均細胞相對活力/空白對照組平均細胞相對活力）×100%][13，15]。

2.6 化州柚花揮發油對肺癌細胞A549遷移能力的影響

采用細胞劃痕實驗[14]考察化州柚花揮發油對肺癌細胞A549遷移能力的影響。體外培養肺癌細胞A549，待其生長至約80%融合時，收集對數生長期細胞適量，經0.25% Trypsin-EDTA溶液消化后計數，按5×105個/孔接種至6孔板中，置于5% CO2、37 ℃細胞培養箱中孵育24 h后，將細胞隨機分為空白對照組和化州柚花揮發油不同劑量組，每組設置3個復孔。吸棄各孔上清液，用200 μL移液槍頭垂直于6孔板背后提前畫好的橫線劃痕，制備體外傷口愈合模型[14]。用PBS清洗3次以除去各孔中的細胞殘骸或碎片?？瞻讓φ战M加入含0.4% DMSO的DMEM培養基2 mL，各給藥組分別加入含不同質量濃度（30、60、120 mg/L，以揮發油質量計；按“2.5”項下劑量倍數遞減）化州柚花揮發油的DMEM培養基2 mL，置于5% CO2、37 ℃細胞培養箱中孵育。分別在孵育0、24、48 h時，置于倒置顯微鏡下拍照，并采用Image J 1.45軟件考察遷移面積，同時計算24、48 h時的相對遷移面積（遷移后無細胞區面積與0 h時無細胞區面積的差值）和遷移抑制率[遷移抑制率（%）=（1-各組平均相對遷移面積/空白對照組平均相對遷移面積）×100%][16]。

2.7 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。采用Shapiro-Wilk檢驗和方差同質性檢驗分別考察數據的正態性和方差齊性。符合正態分布的數據以x±s表示，其中方差齊的采用最小顯著性差異（LSD）檢驗，方差不齊的采用Dunnetts T3檢驗；不符合正態分布的數據以M（P25，P75）表示，采用Mann-Whitney檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 化州柚花揮發油的得率及GC-MS分析

共提取得到化州柚花揮發油0.7 g，得率為0.7%。對揮發油進行GC-MS分析，其總離子流圖見圖1。

采用標準質譜圖庫NIST 11檢索圖1中的各色譜峰，并逐一核對、解析質譜圖以確定各組分名稱和分子式；采用峰面積歸一化法計算各組分的相對百分含量，結果見表1。由表1可見，本研究共分離得46個揮發油組分，共鑒定了其中35個組分，占總峰面積的96.95%，相對百分含量較高的化合物是D-檸檬烯、γ-萜品烯、β-月桂烯、芳樟醇、反-橙花叔醇，分別占28.43%、20.74%、11.97%、7.41%、5.00%，其中D-檸檬烯含量最高，是化州柚花揮發油最主要的化學成分。

3.2 化州柚花揮發油對肺癌細胞A549增殖能力影響的檢測結果

與空白對照組比較，化州柚花揮發油120 mg/L組肺癌細胞A549的相對活力顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05），增殖抑制率升至21.72%；而其他劑量組細胞相對活力與空白對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05），詳見表2。

3.3 化州柚花揮發油對肺癌細胞A549遷移能力影響的檢測結果

與空白對照組比較，作用24、48 h時，30 mg/L化州柚花揮發油對肺癌細胞A549的相對遷移面積均無明顯的抑制作用，相對遷移面積組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；60、120 mg/L的化州柚花揮發油均能顯著抑制肺癌細胞A549的遷移能力，相對遷移面積組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05），遷移抑制率分別為132.46%、125.08%（24 h）和124.54%、124.66%（48 h），詳見圖2、表3。

4 討論

本研究通過GC-MS法分析并鑒定了化州柚花揮發油的化學組成，共分離獲得46個化學組分峰，鑒定了其中35個組分，占總峰面積的96.95%；而其余組分由于含量太少或質譜匹配度過低而無法進行確證。黃蘭珍等[2]同樣采用水蒸氣蒸餾法提取了化州柚花的揮發油，并進行了GC-MS分析，從中分離并鑒定了15個化合物，占總峰面積的82.318%，含量較高的化合物是橙花叔醇（19.27%）、松油烯（12.78%）、芳樟醇（9.87%）、蒎烯（8.54%）、金合歡烯（6.67%）。與之相比，本研究從化州柚花揮發油中分離鑒定的化合物更多、檢出率更高，且含量較高的5個化合物[D-檸檬烯（28.43%）、γ-萜品烯（20.74%）、β-月桂烯（11.97%）、芳樟醇（7.41%）、反-橙花叔醇（5.00%）]也不盡相同，這種差異可能與化州柚的種植環境不同、花的采集時間不同等因素有關[2，17]。韓寒冰等[18]通過無水乙醇超聲輔助提取化州柚花的化學成分，并運用在線凝膠滲透色譜-氣相色譜-質譜聯用技術（GPC-GC/MS）對其揮發油成分進行分離鑒定，共分離出75個組分，鑒定出其中的38個，占總峰面積的96.20%，含量較高的化合物是橙花叔醇（19.57%）、β-月桂烯（14.46%）、法尼醇（13.99%）、γ-萜品烯（7.52%）、β-蒎烯（6.27%）。與本研究相比，上述研究從化州柚花揮發油中分離鑒定的化合物更多，含量較高的5個化合物也不盡相同，提示揮發油提取方法的不同也是造成其化學組成差異的原因之一[19-20]。

本研究采用MTT法初步考察了不同劑量化州柚花揮發油對肺癌細胞A549增殖的體外抑制作用。結果顯示，經120 mg/L化州柚花揮發油作用后，A549細胞的相對活力較空白對照組顯著下降，差異有統計學意義，增殖抑制率升至21.72%；而其他劑量組細胞相對活力與空白對照組比較，差異均無統計學意義。這提示高劑量的化州柚花揮發油對肺癌細胞A549的增殖具有較好的體外抑制作用。此外本研究GC-MS分析結果顯示，化州柚花揮發油中含量最高的化合物是D-檸檬烯。Yu X等[6]在研究中指出，D-檸檬烯（102 mg/L）作用24 h后，肺癌細胞A549的增殖受到了明顯的抑制；同時該研究還指出，D-檸檬烯能夠抑制肺癌細胞A549克隆形成，促進其細胞自噬，誘導其凋亡，具有顯著的抗肺癌活性。由此可見，D-檸檬烯可能是化州柚花揮發油抑制肺癌細胞A549增殖的主要活性成分之一。

本研究采用細胞劃痕實驗初步評價了化州柚花揮發油對肺癌細胞A549遷移能力的影響。該模型是經典的細胞遷移能力評價方法。結果顯示，與空白對照組比較，作用24、48 h時，30 mg/L化州柚花揮發油對肺癌細胞A549的遷移能力均無明顯的抑制作用，相對遷移面積組間比較，差異均無統計學意義；60、120 mg/L化州柚花揮發油均能顯著抑制肺癌細胞A549的遷移能力，相對遷移面積組間比較，差異均有統計學意義，遷移抑制率分別為132.46%、125.08%（24 h）和124.54%、124.66%（48 h）。在研究過程中筆者發現，經60、120 mg/L化州柚花揮發油作用后，A549細胞的輪廓不清晰，疑似處于凋亡狀態，同時其遷移抑制率較空白對照組和化州柚花揮發油30 mg/L組均明顯升高，提示這種抑制作用可能與細胞凋亡有關，但具體機制尚有待進一步研究。此外相關研究指出，D-檸檬烯能促進肺癌細胞A549發生自噬，并誘導其凋亡[6]，表明該化合物可能是化州柚花揮發油抑制細胞遷移的主要活性成分之一。

綜上所述，本研究采用GC-MS法從化州柚花揮發油中分離鑒定了35個化合物，以D-檸檬烯、γ-萜品烯、β-月桂烯等成分為主。體外試驗結果表明，120 mg/L化州柚花揮發油對肺癌細胞A549的增殖能力具有明顯的抑制作用；60、120 mg/L化州柚花揮發油對其遷移能力亦具有明顯的抑制作用，但其具體作用機制仍有待后續深入探討。

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（收稿日期：2018-05-30 修回日期：2018-08-28）

（編輯：張元媛）