膽石六號顆粒對模型小鼠非酒精性脂肪肝的改善作用研究

譚丹楓 陶月英 姜媛 田應彪 陳澤慧

摘 要 目的：觀察膽石六號顆粒對模型小鼠非酒精性脂肪肝的改善作用。方法：60只雌性昆明種小鼠隨機分成正常對照組（0.9%氯化鈉溶液）、模型組（0.9%氯化鈉溶液）、辛伐他汀組（3 mg/kg）和膽石六號顆粒低、中、高劑量組（5.5、11、22 g/kg），每組10只。用高脂飼料連續喂養模型組和各給藥組小鼠8周，以建立非酒精性脂肪肝模型。造模成功后各給藥組小鼠灌胃相應藥物，每天1次，連續4周。末次給藥后，測定小鼠血清中膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）含量和天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）活性；稱定小鼠體質量和肝濕質量，并計算其肝指數；觀察小鼠肝臟大體形態和肝組織病理形態，并進行病理形態學評分；測定小鼠肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。結果：與正常對照組比較，模型組小鼠血清中TC、TG、LDL含量均顯著增加，HDL含量顯著減少，AST、ALT活性均顯著增強（P<0.01）；肝指數顯著升高（P<0.01）；大體形態觀察可見肝臟腫大呈灰白色，質地較硬，捏之有顆粒及油膩感，邊緣較圓鈍；病理形態觀察可見肝小葉界限不清晰，肝細胞腫脹，細胞質出現大量球形脂滴，已進展至非酒精性脂肪肝階段；病理形態學評分顯著升高（P<0.01）；肝組織中SOD活性顯著減弱，MDA含量顯著增加（P<0.01）。與模型組比較，辛伐他汀組和膽石六號顆粒低、中、高劑量組小鼠血清中TC含量均顯著減少，AST、ALT活性均顯著減弱（P<0.05或P<0.01）；辛伐他汀組和膽石六號顆粒中、高劑量組小鼠血清中TG、LDL含量均顯著減少，HDL含量均顯著增加；肝指數均顯著降低（P<0.05）；肝臟顏色、質地和形態趨于正常；病理形態明顯改善，脂肪變性細胞明顯減少；病理形態學評分均顯著降低（P<0.01）；肝組織中SOD活性均顯著增強，MDA含量均顯著減少（P<0.01）。結論：膽石六號顆粒可以降低高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝模型小鼠的病變程度，其機制與改善脂代謝紊亂、抗氧化應激及脂質過氧化有關。

關鍵詞 非酒精性脂肪肝；膽石六號顆粒；膽固醇；三酰甘油；高密度脂蛋白；低密度脂蛋白；天冬氨酸轉氨酶；丙氨酸轉氨酶；超氧化物歧化酶；丙二醛；小鼠

中圖分類號 R285.5；R965.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）22-3106-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.18

ABSTRACT OBJECTIVE： To observe the improvement effects of Danshi Ⅵ granules on the non-alcoholic fatty liver disease in model mice. METHODS： Totally 60 female Kunming mice were randomly divided into normal control group （constant volume of 0.9% Sodium chloride solution）， model group （constant volume of 0.9% Sodium chloride solution）， simvastatin group （3 mg/kg） and Danshi Ⅵ granules low-dose， medium-dose and high-dose groups （5.5， 11， 22 g/kg）， with 10 mice in each group. The model group and administration groups received high-fat diet for consecutive 8 weeks to establish non-alcoholic fatty liver disease model. After modeling， they were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 4 weeks. After the last administration the contents of TC， TG， HDL， LDL， and the contents of AST， ALT were determined. Body weight and liver wet weight of mice were weighed， and liver indexes were calculated. Gross morphology and pathological changes of liver tissue in mice were observed， and pathological morphology grading was also performed. SOD activity and MDA content were determined in liver tissue of mice. RESULTS： Compared with normal control group， liver indexes of model group were increased significantly （P<0.01）； serum contents of TC， TG， LDL， AST and ALT were significantly increased while HDL content was decreased significantly （P<0.01）. The gross morphology of liver tissue was swollen， gray-white， hard， pinched with granules and greasy feeling， the edge of the round blunt. Pathomorphology showed that the boundary of hepatic lobules was not clear， hepatocytes were swollen， and a large number of spherical lipid droplets appeared in the cytoplasm， which had progressed to the stage of non-alcoholic fatty liver disease. Pathomorphologic score was increased significantly （P<0.01）. In liver tissue， SOD activity decreased significantly， while HDL content decreased significantly （P<0.01）. Compared with model group， serum contents of TC were decreased significantly in simvastatin group， Danshi Ⅵ granules low-dose， medium-dose and high-dose groups， while AST and ALT activities were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）； the contents of TG and LDL were decreased significantly， while HDL content was increased significantly； liver indexes of simvastatin group and Danshi Ⅵ granules medium-dose and high-dose groups were decreased significantly （P<0.05）； liver color， texture and morphology tended to normal； pathomorphology improved significantly； the number of steatosis cells was decreased significantly； pathomorphology score was decreased significantly； SOD activity of liver tissue was enhanced significantly while MDA content was decreased significantly （P<0.01）. CONCLUSIONS： Danshi Ⅵ granules can reduce the degree of non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced model mice， the mechanism of which may be associated with improving lipid metabolism disorder， anti-oxidative stress and lipid peroxidation.

KEYWORDS Non-alcoholic fatty liver； Danshi Ⅵ granules； TC； TG； HDL； LDL； AST； ALT； MDA； SOD； Mice

脂肪肝指肝臟彌漫性脂肪浸潤，可伴有肝內炎癥、肝細胞壞死、肝再生受損、肝星狀細胞活化及肝纖維化形成等病理學改變[1]。非酒精性脂肪肝是一種肝組織病理學改變與酒精性脂肪肝相似，但無過量飲酒史的臨床病理綜合征[2]。目前，非酒精性脂肪肝流行病學調查顯示，其在美國的發病率為15%～40%，亞洲國家的發病率為9%～40%[3]，現已成為嚴重危害人類健康的三大肝病之一。因此，對非酒精性脂肪肝的防治已成為研究熱點。

膽石六號顆粒源自遵義醫學院附屬醫院的經驗方膽石六號湯（經現代提取工藝精制而成），該方劑長期應用于臨床，主要用于膽囊炎、膽結石等癥的治療，療效確切、使用安全[4]。本課題組前期研究表明，膽石六號顆粒具有調脂保肝的作用[5]，但其是否具有治療非酒精性脂肪肝的作用尚未見文獻報道。因此，本研究用高脂飼料連續喂養小鼠以建立非酒精性脂肪肝模型[6]，觀察給予膽石六號顆粒后對模型小鼠非酒精性脂肪肝的改善作用，以為其臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Plus384型全波長酶標儀、DX43/DP26型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；Vevo2100型超高分辨率小動物超聲成像系統[維勝中國（有限）公司]；TGL 16M型臺式高速冷凍離心機（長沙邁佳森儀器設備有限公司）；S10型手持式高速勻漿機（寧波新藝超聲設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

膽石六號顆粒（按本課題組前期確定的制備方法[5]制備，批號：170815，規格：25 g/袋）；辛伐他汀片（山東羅欣藥業股份有限公司，批號：20170308，規格：20 mg/片）；三酰甘油（TG）測定試劑盒（批號：20171203）、總膽固醇（TC）測定試劑盒（批號：20171206）、高密度脂蛋白（HDL）測定試劑盒（批號：20171204）、低密度脂蛋白（LDL）測定試劑盒（批號：20171205）、天冬氨酸轉氨酶（AST）測定試劑盒（批號：20171208）、丙氨酸轉氨酶（ALT）測定試劑盒（批號：20171207）、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（批號：20171201）、丙二醛（MDA）測定試劑盒（批號：20171205）均購自南京建成生物工程研究所；蘇木素-伊紅（HE）染液（北京雷根生物技術有限公司，批號：20171206）；其余試劑為分析純，水為純化水。

1.3 動物與飼料

清潔級雌性昆明種小鼠，8周齡，體質量（20±2）g，由陸軍軍醫大學實驗動物中心提供[動物生產許可證號：SCXK（渝）2012-0005]。標準條件飼養，自由進食、飲水，適宜溫度、濕度，人工黑暗和光照交替。普通飼料、高脂飼料（豬油15%、膽固醇2%、膽酸0.5%、普通混合飼料粉82.5%）均由陸軍軍醫大學實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

適應性喂養1周后，60只小鼠隨機分成正常對照組（等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（等體積0.9%氯化鈉溶液）、辛伐他汀組（陽性對照，3 mg/kg）[6]和膽石六號顆粒低、中、高劑量組（5.5、11、22 g/kg）[5]，每組10只。用高脂飼料連續喂養模型組、辛伐他汀組和膽石六號顆粒低、中、高劑量組小鼠8周，以建立非酒精性脂肪肝模型[7]；采用小動物超聲成像系統對其進行肝臟B超檢測，以確定造模成功與否。造模成功后各給藥組小鼠均灌胃相應藥物，每天1次，連續4周。

2.2 血清相關指標的測定

末次給藥后禁食不禁水12 h，經小鼠眼球取血約1 mL，置于1.5 mL離心管中，3 000 r/min離心10 min，取上清液。采用酶標儀測定血清中TC、TG、HDL、LDL、AST和ALT的吸光度，并計算其含量或活性，嚴格按照測定試劑盒說明書操作。

2.3 肝指數的計算

取血后，稱定小鼠體質量，處死小鼠后取出肝臟，以冰0.9%氯化鈉溶液洗凈血污，以濾紙吸干多余水分，稱定肝濕質量，并計算肝指數（肝濕質量/體質量）。

2.4 肝臟大體形態和肝組織病理形態的觀察及病理形態學評分

取上述小鼠肝臟，肉眼觀察其大體形態；取肝左葉同一部位的肝組織約1 cm2，以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片（厚度：3 μm），經脫蠟、水化、染色、脫水、封片后，置于光學顯微鏡下隨機選取5個視野觀察肝組織病理形態學變化。同時，進行肝組織病理形態學評分，相關標準參考文獻[8]：0分為無損傷，脂肪變性的肝細胞<5%；1分為輕度損傷，脂肪變性的肝細胞為5%～<33%；2分為中度損傷，脂肪變性的肝細胞為33%～<66%；3分為重度損傷，脂肪變性的肝細胞≥66%。

2.5 肝組織相關指標的測定

取“2.4”項下小鼠肝臟相同部位的肝組織100 mg，置于0.9 mL 0.9%氯化鈉溶液（勻漿介質）中，冰浴條件下2 000 r/min勻漿3～5 min，制成10%肝組織勻漿。采用酶標儀測定肝組織中SOD和MDA的吸光度，根據公式計算其活性或含量，嚴格按照測定試劑盒說明書操作。

2.6 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠肝臟B超聲像圖

用普通飼料或高脂飼料連續喂養小鼠8周后，肝臟B超聲像圖顯示、正常對照組小鼠肝左葉較小、肝右葉較大，肝左葉較薄、肝右葉較厚，邊緣較鈍；肝實質回聲呈均勻彌散分布的細小光點回聲，與腎實質回聲相似，比胰腺實質回聲稍弱。與正常對照組比較，模型組、辛伐他汀組和膽石六號顆粒低、中、高劑量組小鼠肝內脈管顯示不清；肝實質內彌散分布細密高回聲斑點，回聲水平高于腎實質，可證實非酒精性脂肪肝模型建立成功，詳見圖1。

3.2 各組小鼠存活情況

模型組、辛伐他汀組和膽石六號顆粒低劑量組各有1只小鼠死亡，膽石六號顆粒高劑量組有2只小鼠死亡。

3.3 各組小鼠血清中TC、TG、HDL、LDL含量比較

與正常對照組比較，模型組小鼠血清中TC、TG、LDL含量均顯著增加，HDL含量顯著減少，差異均有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，辛伐他汀組和膽石六號顆粒中、高劑量組小鼠血清中TG、LDL含量均顯著減少，HDL含量均顯著增加；辛伐他汀組和膽石六號顆粒低、中、高劑量組小鼠血清中TC含量均顯著減少，差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.4 各組小鼠血清中AST、ALT活性比較

與正常對照組比較，模型組小鼠血清AST、ALT活性均顯著增強，差異均有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，辛伐他汀組和膽石六號顆粒低、中、高劑量組小鼠血清中AST、ALT活性均顯著減弱，差異均有統計學意義（P<0.01），詳見表2。

3.5 各組小鼠體質量、肝濕質量和肝指數比較

與正常對照組比較，模型組小鼠肝指數顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，辛伐他汀組和膽石六號顆粒中、高劑量組小鼠肝指數均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；而各給藥組小鼠體質量、肝濕質量與模型組比較，膽石六號顆粒低劑量組小鼠肝指數與模型組比較，差異均無統計學意義（P>0.05），詳見表3。

3.6 各組小鼠肝臟大體形態比較

正常對照組小鼠肝臟呈紅棕色，質地柔軟而脆弱，肝略呈楔形，右端圓鈍而厚，左端窄而薄；模型組小鼠肝臟腫大呈灰白色，質地較硬，捏之有顆粒及油膩感，邊緣較圓鈍；辛伐他汀組和膽石六號顆粒中、高劑量組小鼠肝臟顏色介于正常對照組與模型組之間，質地和形態趨于正常組。

3.7 各組小鼠肝組織病理形態比較

正常對照組小鼠肝組織結構正常，肝小葉結構清晰，中央靜脈均勻分布，周圍細胞索呈放射狀排列，肝竇正常，細胞中央有大而圓的核，細胞質均勻，無脂肪變性細胞。模型組小鼠肝小葉界限不清晰，肝細胞腫脹，細胞質出現大量球形脂滴，呈空泡狀，細胞核被擠壓至細胞邊緣，伴有不同程度的肝細胞壞死，匯管區有以單核、淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤，部分細胞出現點狀壞死和灶狀壞死，已進展至非酒精性脂肪肝階段。與模型組比較，辛伐他汀組和膽石六號顆粒中、高劑量組小鼠肝組織病理形態明顯改善，脂肪變性空泡狀肝細胞明顯減少，且接近正常細胞，詳見圖2。

3.8 各組小鼠肝組織病理形態學評分比較

與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織病理形態學評分顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，辛伐他汀組和膽石六號顆粒中、高劑量組小鼠肝組織病理形態學評分均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.01），詳見表4。

3.9 各組小鼠肝組織中SOD活性和MDA含量比較

與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織中SOD活性顯著減弱，MDA含量顯著增加，差異均有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，辛伐他汀組和膽石六號顆粒中、高劑量組小鼠肝組織中SOD活性均顯著增強，MDA含量均顯著減少，差異均有統計學意義（P<0.01），詳見表5。

4 討論

肝膽疾病是現代臨床最常見的疾病，其中非酒精性脂肪肝發展迅速，且常常伴隨明顯的血脂代謝紊亂，易從單純性脂肪肝演變成脂肪性肝炎、肝硬化甚至肝癌[9]。而50歲后女性非酒精性脂肪肝的發病率是同年齡男性的1.5倍[10]，且呈低齡化發展趨勢。因此，有效治療非酒精性脂肪肝具有重要意義。

目前，治療非酒精性脂肪肝的藥物較多，包括多烯磷脂酰膽堿、水飛薊素、維生素E、熊去氧膽酸、他汀類藥物、還原性谷胱甘肽、硫普羅寧等[11]。現有研究表明，上述藥物可使非酒精性脂肪肝模型動物血清轉氨酶活性減弱，肝組織病變程度降低，血脂代謝改善，但作用較為單一，無法全面地改善非酒精性脂肪肝的病理狀態或恢復肝功能[12]。膽石六號顆粒由金錢草、大黃、枳殼、元胡、木香、虎杖、梔子、芒硝等8味中藥組成，根據中醫理論，方中金錢草、大黃為君藥，枳殼、元胡為臣藥，木香、虎杖為佐藥，梔子、芒硝為使藥。其中，金錢草具有清熱、利尿、排石和保肝作用[13]；大黃具有瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經的作用[14]；梔子具有清熱解毒、瀉熱通便、清火消腫的作用[15]。本實驗結果顯示，連續4周給予模型小鼠灌胃膽石六號顆粒，其血清中TC、TG、LDL含量均顯著減少，HDL含量均顯著增加，說明該藥具有調脂作用；其血清中AST、ALT活性均顯著減弱，說明該藥具有改善肝功能的作用；其肝組織中SOD 活性均顯著增強，MDA 含量均顯著減少，說明該藥具有抗氧化應激及抗脂質過氧化的作用。其肝臟大體形態觀察可見病理形態可見膽組織脂肪變性情況改善，且肝病病理形態學評分顯著降低，說明該藥具有保護肝臟的作用。

綜上所述，膽石六號顆粒可以降低高脂飲食誘導的非酒精性脂肪肝模型小鼠的病變程度，其機制與改善脂代謝紊亂、抗氧化應激及脂質過氧化有關。

參考文獻

[ 1 ] ROTMAN Y，SANYAL AJ. Current and upcoming pharmacotherapy for non-alcoholic fatty liver disease[J]. Gut，2017，66（1）：180-192.

[ 2 ] BELLENTANI S，SCAGLIONI F，et al. Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease[J]. Dig Dis，2017，28（1）：155-161.

[ 3 ] BENEDICT M，ZHANG X. Non-alcoholic fatty liver disease： an expanded review[J]. World J Hepatol，2017，9（16）：715-732.

[ 4 ] 易學東，羅亞文. 膽石六號濃縮液在黃疸型肝炎44例臨床分析[J]. 遵義醫學院學報，2005，28（1）：45.

[ 5 ] 劉燕. 膽石六號顆粒劑的制備工藝、質量控制及初步藥效學研究[D]. 遵義：遵義醫學院，2017.

[ 6 ] 胡文兵，趙靜，陳婷婷，等. 青錢柳多糖對高脂血癥小鼠的降血脂作用及機制初探[J]. 現代食品科技，2015，31（11）：39-44.

[ 7 ] VAN HERCK MA，VONGHIA L. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease：a starters guide[J]. Nutrients，2017，9（10）：1072-1085.

[ 8 ] 范建高，曾民德. 脂肪性肝病[M].2版. 北京：人民衛生出版社，2013：115-116.

[ 9 ] BEDOSSA P. Pathology of non-alcoholic fatty liver disease[J]. Liver Int，2017，37（S1）：85-90.

[10] 葛曉春，王英南，劉曉燕，等. 血脂康膠囊治療絕經后女性2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝的臨床觀察[J]. 中國藥房，2016，27（33）：4641-4643.

[11] 中華醫學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組. 非酒精性脂肪性肝病防治指南：2018年更新版[J]. 實用肝臟病雜志，2018，21（2）：177-186.

[12] 陳婷，葉曉光. 常用非酒精性脂肪性肝病藥物治療方案的藥物經濟學評價[J]. 肝臟，2017，22（9）：794-799.

[13] 熊穎，王俊文，鄧君. 金錢草和廣金錢草的藥理作用比較[J]. 中國中藥雜志，2015，40（11）：2106-2111.

[14] 張榮臻，毛德文，王璐，等. 不同劑量大黃、赤芍對肝衰竭大鼠肝功能的影響[J]. 遼寧中醫雜志，2017，44（7）：1518-1519.

[15] 肖日傳，羅光明，張風波，等. 梔子根醇提物對CCl4致小鼠急性肝損傷的保護作用[J]. 中藥藥理與臨床，2017，33（3）：114-117.

（收稿日期：2018-01-08 修回日期：2018-03-16）

（編輯：張 靜）