山茱萸不同部位提取物對急性肝損傷模型小鼠的保肝作用研究

南美娟 唐凱 張化為 崔春利 鄧翀

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）17-2385-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.19

摘 要 目的：研究山茱萸不同部位（果肉、果核和全果）提取物對醋氨酚所致小鼠急性肝損傷的保護作用，為其全面開發利用提供參考。方法：將120只小鼠隨機分為正常對照組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、聯苯雙酯組（陽性對照，150 mg/kg）和山茱萸果肉、果核、全果提取物的低、中、高劑量組（以生藥量計為1.56、6.24、12.48 g/kg），每組10只。灌胃給藥，每天1次，連續7 d。末次給藥后6 h，正常對照組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組小鼠腹腔注射醋氨酚300 mg/kg制備肝損傷模型。成模16 h后，測定小鼠血清中丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙二醛（MDA）以及肝組織中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）水平，蘇木精-伊紅染色后觀察小鼠肝組織病理變化。結果：與正常對照組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST、MDA水平顯著升高（P<0.01），肝組織中SOD、GSH-Px水平顯著降低（P<0.01）；肝組織可見炎性細胞浸潤，伴隨肝細胞變性、片狀壞死。與模型組比較，山茱萸果肉提取物中劑量組小鼠血清中ALT、AST、MDA水平和山茱萸果肉提取物高劑量組小鼠血清中ALT、MDA水平顯著降低（P<0.05或P<0.01），山茱萸果核提取物低劑量組小鼠血清中MDA水平和山茱萸果核提取物中、高劑量組小鼠血清中ALT、AST水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），山茱萸全果提取物中、高劑量組小鼠血清中ALT、AST水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；山茱萸不同部位提取物中、高劑量組小鼠肝細胞壞死均有不同程度減輕，其中山茱萸果核提取物中、高劑量組和山茱萸全果高劑量組小鼠肝小葉結構基本完整，未出現肝細胞片狀壞死現象。結論：山茱萸不同部位提取物對醋氨酚所致急性肝損傷模型小鼠均具有保護作用，且以果核提取物作用最好；其保肝機制可能與抗氧化應激反應有關。

關鍵詞 山茱萸；不同部位；醋氨酚；急性肝損傷；保肝作用；氧化應激；小鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the protective effects of different parts （fruit pulp， fruit core， whole fruit） extracts of Cornus officinalis on acetaminophen-induced acute liver injury in mice， and to provide reference for its complete development and utilization. METHODS： Totally 120 mice were randomly divided into normal control group （normal saline）， model group （normal saline）， bifendate group （positive control， 150 mg/kg）， low-dose， medium-dose and high-dose groups （1.56， 6.24， 12.48 g/kg， calculated by crude drug） of C. officinalis fruit pulp， fruit core， whole fruit extracts， with 10 mice in each group. They were given relevant medicine intragastrically once a day for consecutive 7 d. 6 h after last medication， normal control group was given normal saline intraperitoneally， and other groups were given acetaminophen 300 mg/kg intraperitoneally to induce liver injury model. 16 h after modeling， the levels of ALT， AST and MDA in serum as well as the levels of GSH-Px and SOD in liver tissue were determined. HE staining was used to observe the pathological changes of liver tissue in mice. RESULTS： Compared with normal control group， the serum levels of ALT， AST and MDA in model group were increased significantly （P<0.01）， while the levels of SOD and GSH-Px in liver tissue were decreased significantly （P<0.01）； the inflammatory cell infiltration was observed in the liver tissue of the model group， accompanied by hepatocyte degeneration and flaky necrosis. Compared with model group， the serum levels of ALT， AST and MDA in C. officinalis fruit pulp extracts medium-dose group as well as the serum levels of ALT and MDA in C. officinalis fruit pulp extracts high-dose group were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Serum level of MDA in C. officinalis fruit core extracts low-dose group， the serum levels of ALT and AST in C. officinalis fruit core extracts medium-dose and high-dose groups were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The serum levels of ALT and AST were decreased significantly in C. officinalis fruit extracts medium-dose and high-dose groups （P<0.05 or P<0.01）. The necrosis of liver cells was relieved in different parts of extracts C. officinalis middle-dose and high-dose groups to different extent. The structure of liver lobule was basically intact， and no necrosis of liver cells was observed in C. officinalis fruit core medium-dose and high-dose groups， C. officinalis fruit extracts high-dose group. CONCLUSIONS： Different parts extracts of C. officinalis have protective effects against acetaminophen-induced acute liver injury model mice， and the effect of C. officinalis fruit core extracts is similar to that of C. officinalis fruit extracts. The mechanism of hepatoprotection may be related to anti-oxidative stress reaction.

KEYWORDS Cornus officinalis； Different parts； Acetaminophen； Acute liver injury； Liver protection； Oxidative stress； Mice

山茱萸來源于山茱萸科山茱萸屬植物山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et Zucc.）的干燥成熟果肉，味酸、澀，性微溫，歸肝、腎經，具有補益肝腎、澀精固脫的功效[1]。山茱萸果核約占其全果質量的2/3，臨床應用多以山茱萸果肉入藥，而果核長期以來被當作廢棄物丟棄，造成資源的極大浪費。有研究表明，山茱萸果核中部分成分與果肉相似，只是含量有所差異[2-3]?，F代藥理研究表明，山茱萸果肉具有保肝、抗氧化、神經保護、心肌保護等功效[4-6]，而山茱萸果核同樣具有抗氧化、抗衰老、抗疲勞、神經保護、心肌保護、抗菌、消炎等作用[7-11]，這提示山茱萸果核具有潛在的開發利用價值。因此，本研究將圍繞開發利用山茱萸果核來探討山茱萸不同部位的保肝作用。

醋氨酚，學名對乙酰氨基酚，具有解熱鎮痛的功效，過量使用有可能導致急性藥物性肝損傷，且因其引起的肝損傷比例要遠高于其他原因所致的肝損傷[12]。故本研究采用醋氨酚制備小鼠急性藥物性肝損傷模型，研究山茱萸果肉、果核及全果對小鼠的保肝作用，為山茱萸的全面開發利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

AL204電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，d=0.1 mg]； ELx808吸收光酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）；TDL-60B低速離心機（上海安亭科學儀器廠）；e200生物顯微鏡[尼康儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

山茱萸藥材采集于陜西中醫藥大學藥用植物園（由陜西中醫藥大學胡本祥教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸）；醋氨酚標準品（上海源葉生物科技有限公司，批號：S31044，純度：99.0%）；聯苯雙酯滴丸（萬邦德制藥集團股份有限公司，批號：A02J151215，規格：1.5 mg/丸）；丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號依次為20171230、20171230、20180103、20180103、20180103）；乙醇、甲醛等均為分析純。

1.3 動物

KM小鼠120只，清潔級，♀♂各半，體質量18～22 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，實驗動物生產合格證號：SCXK（川）2015-30。小鼠購入后，飼養于溫度為18～23 ℃、相對濕度為45%～65%的動物房內。

2 方法

2.1 山茱萸不同部位提取物的制備

2.1.1 山茱萸果肉提取物 取山茱萸果肉，50 ℃烘干，取出，粉碎，過60目篩。精密稱定果肉粉末約100 g，用8倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h。過濾，合并2次濾液，旋轉蒸發溶劑，得山茱萸果肉提取物，得率為38.12%。

2.1.2 山茱萸果核提取物 取山茱萸果核，50 ℃烘干，取出，粉碎，過60目篩。精密稱定果核粉末約100 g，用12倍量60%乙醇回流提取2次，每次1.5 h。過濾，合并2次濾液，旋轉蒸發溶劑，得山茱萸果核提取物，得率為39.94%。

2.1.3 山茱萸全果提取物 取山茱萸全果，50 ℃烘干，取出，粉碎，過60目篩。精密稱定全果粉末約100 g，用10倍量50%乙醇回流提取3次，每次1 h。過濾，合并3次濾液，旋轉蒸發溶劑，得山茱萸全果提取物，得率為37.11%。

2.2 分組、給藥與造模

將120只小鼠隨機分為12組，分別為正常對照組、模型組、聯苯雙酯組（陽性對照）和山茱萸果肉、果核、全果提取物的低、中、高劑量組，每組10只。山茱萸果肉、果核、全果提取物的低、中、高劑量組小鼠分別灌胃按生藥量計為1.56、6.24、12.48 g/kg的提取物[劑量參照2015年版《中國藥典》（一部）中山茱萸用法用量及預實驗結果設置]，正常對照組和模型組小鼠灌胃等體積的生理鹽水，聯苯雙酯組小鼠灌胃聯苯雙酯150 mg/kg[13]。每天給藥1次，連續給藥7 d。正常對照組小鼠于末次給藥后6 h腹腔注射生理鹽水；其余各組小鼠于末次給藥后6 h腹腔注射醋氨酚300 mg/kg，復制肝損傷模型[14]。

2.3 標本采集與處理

造模后各組小鼠均禁食不禁水，16 h后小鼠眼球取血，在4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min，分離血清，進行生化指標檢測；剪取適量相同位置的肝組織標本，用10%的多聚甲醛溶液固定，進行肝組織形態學考察；取適量的肝組織于-70 ℃冷凍待用，用時取出，按肝質量（g） ∶ 體積（mL）=1 ∶ 9的比例加入生理鹽水制備成10%肝組織勻漿。

2.4 生化指標檢測

血清中ALT、AST、MDA水平的測定及肝組織中SOD、GSH-Px水平的測定均按照相應試劑盒說明書步驟操作。

2.5 肝組織病理學觀察

取小鼠相同位置肝組織，用生理鹽水沖洗干凈后，濾紙拭干，浸泡于10%的多聚甲醛溶液中固定，常規石蠟包埋、切片（厚度4 ?m），蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察肝組織切片的病理學變化。

2.6 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。數據以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠血清中ALT、AST水平測定結果

與正常對照組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，聯苯雙酯組小鼠血清中僅ALT水平顯著降低（P<0.05）；山茱萸果肉提取物中劑量組小鼠血清中ALT、AST水平以及山茱萸果肉提取物高劑量組小鼠血清中ALT水平顯著降低（P<0.05）；山茱萸果核提取物中、高劑量組小鼠血清中ALT、AST水平顯著降低（P<0.01）；山茱萸全果提取物中、高劑量組小鼠血清中ALT、AST水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠血清中ALT、AST水平測定結果見表1。

3.2 小鼠血清中MDA水平和肝組織中SOD、GSH-Px水平測定結果

與正常對照組比較，模型組小鼠血清中MDA水平顯著升高（P<0.01），肝組織中SOD、GSH-Px水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，聯苯雙酯組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px水平顯著升高（P<0.01）；山茱萸果肉提取物中、高劑量組小鼠血清中MDA水平顯著降低（P<0.05或P<0.01），山茱萸果肉提取物中劑量組中小鼠肝組織中SOD、GSH-Px水平和山茱萸果肉高劑量組小鼠肝組織中GSH-Px水平顯著升高（P<0.01）；山茱萸果核提取物各劑量組小鼠血清中MDA水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），肝組織中SOD、GSH-Px水平均顯著升高（P<0.01）；山茱萸全果提取物中、高劑量組小鼠血清中MDA水平顯著降低（P<0.01），山茱萸全果提取物低劑量組小鼠肝組織中SOD水平以及山茱萸全果提取物中、高劑量組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠血清中MDA水平及肝組織中SOD、GSH-Px水平測定結果見表2。

3.3 小鼠肝組織病理學的觀察結果

正常對照組小鼠肝組織正常，肝細胞呈放射狀排列整齊，肝小葉結構完整。模型組小鼠肝組織均可見炎性細胞浸潤，伴隨肝細胞變性、片狀壞死，肝小葉中央區周圍細胞可見核破碎、甚至消失。與模型組比較，聯苯雙酯組和山茱萸果核、全果、果肉提取物的中、高劑量組小鼠的肝組織病變均有不同程度改善，肝細胞壞死明顯減輕，其中山茱萸果核提取物中、高劑量組和山茱萸全果提取物高劑量組小鼠未見肝細胞片狀壞死，肝小葉結構基本完整，效果優于果肉。各組小鼠肝組織病理學觀察結果見圖1。

4 討論

醋氨酚致急性肝損傷是藥物性肝損傷中最主要的一種類型，并且采用醋氨酚誘導實驗動物產生的肝損傷與人肝損傷病理表現相似，常用作篩選保肝藥物實驗肝損傷模型的制備，故本研究選用在醋氨酚肝損傷小鼠模型上探討山茱萸果肉、果核及全果提取物不同劑量的藥效作用。本研究造模結果與文獻報道的研究結果相一致[15]，大劑量醋氨酚可使急性肝損傷小鼠血清中ALT、AST和MDA水平顯著升高，病理切片觀察到模型組小鼠肝組織中存在變性及片狀壞死，說明醋氨酚致急性肝損傷小鼠模型成功建立。

聯苯雙酯對肝損傷具有確切的防治作用，可以降低肝損傷患者血清中ALT、AST水平，故本研究以其為陽性對照藥物[16]。ALT與AST是診斷肝疾病最常用的酶，肝損傷后，小鼠肝細胞發生嚴重損傷，胞漿、線粒體中的酶釋放入血，導致血清中ALT、AST水平顯著升高。故本研究選擇血清中ALT、AST水平來反映肝細胞受損的嚴重程度。本研究結果顯示，中、高劑量山茱萸果核提取物和山茱萸全果提取物均能顯著降低肝損傷小鼠血清中ALT、AST水平，且變化水平較山茱萸果肉提取物組更明顯，這提示山茱萸果核具有較好的保肝作用，且作用優于山茱萸果肉。此外，GSH-Px、SOD是機體內分解過氧化物的酶，MDA是機體脂質過氧化的終產物，MDA水平升高，SOD和GSH-Px水平降低，可引發氧化應激反應，導致細胞損傷。有文獻研究結果表明[17]，醋氨酚誘導的肝損傷常伴有氧化應激反應的發生。因此本研究分別檢測了GSH-Px、SOD和MDA的水平，來反映肝細胞的受損程度。結果顯示，各劑量山茱萸果核提取物均能顯著升高肝損傷小鼠肝組織中GSH-Px、SOD水平，顯著降低肝組織中MDA水平，表現出較好的抗氧化活性；此外，中劑量山茱萸果肉提取物和中、高劑量山茱萸全果提取物也能顯著升高肝損傷小鼠肝組織中GSH-Px、SOD水平，并降低血清中MDA水平。

綜上所述，山茱萸藥材不同部位提取物對醋氨酚所致小鼠急性肝損傷均具有不同程度的保護作用，且山茱萸果核提取物的效果優于山茱萸全果、果肉提取物，尤以中、高劑量山茱萸果核提取物保肝作用最為顯著，這提示山茱萸果核可能具有較強的抗藥物性肝損傷的潛力，可以作為保肝的藥物被開發利用，其保肝機制可能是通過抗氧化應激抑制血清中ALT、AST、MDA水平的升高以及肝組織中SOD、GSH-Px水平的降低有關。

參考文獻

[ 1 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：27-28.

[ 2 ] 張紅玉，徐建偉，汪利麗.山茱萸果核與果肉的抗炎藥理作用對比性研究[J].浙江中醫雜志，2007，42（12）：724- 725.

[ 3 ] 彭勃，季玉榮.山茱萸果核與果肉化學成分的對比分析[J].河南中醫藥學刊，1999，14（2）：13-14.

[ 4 ] 姜澤群，李育，江勵華，等.制山茱萸活性部位對D-半乳糖致小鼠肝損傷的保護作用[J].中藥材，2013，36（1）：85-89.

[ 5 ] 張艷萍，戴志遠.山茱萸提取物不同極性部位體外抗氧化活性研究[J].中國糧油學報，2009，24（3）：98-102.

[ 6 ] 楊明明，袁曉旭，趙桂琴，等.山茱萸化學成分和藥理作用的研究進展[J].承德醫學院學報，2016，33（5）：398-400.

[ 7 ] 胡志紅，閆君寶，路西明.山茱萸果核醇提物對D-半乳糖衰老小鼠學習記憶及抗氧化能力的影響[J].時珍國醫國藥，2016，27（8）：1799-1801.

[ 8 ] 李曉明，姜華，李軍，等.山茱萸果核中多酚的抗氧化活性研究[J].時珍國醫國藥，2012，23（4）：902-903.

[ 9 ] 方偉進，李艷，曹珊珊，等.山茱萸果核提取物耐疲勞和耐缺氧作用研究[J].河南科技大學學報（醫學版），2011，29（3）：167-169.

[10] 孫冠鐸，胡志紅，宋虎，等.山茱萸果核水提取物對東莨菪堿模型小鼠學習記憶的影響[J].河南科技大學學報（醫學版），2015，33（2）：81-83.

[11] 李曉明.山茱萸果核抗氧化活性的相關研究[D].洛陽：河南科技大學，2012.

[12] LEE WM. Acetaminophen-related acute liver failure in the United States[J]. Hepatol Res，2008，38（1）：S3-S8.

[13] 徐博，沈楠，安英，等.漢防己多糖對急性酒精性肝損傷小鼠氧化應激及肝細胞凋亡的影響[J].中國藥房，2017，28（7）：885-888.

[14] 謝斌，俞大軍，程紹民.加味小柴胡湯對醋氨酚所致肝損傷的保護作用[J].時珍國醫國藥，2008，19（1）：130-131.

[15] MASUBUCHI Y，SUDA C，HORIE T. Involvement of mitochondrial permeability transit in acetaminophen-induced liver injury in mice[J]. J Hepatol，2005，42（1）：110-116.

[16] 王春梅，李賀，李生，等.北五味子木脂素對小鼠酒精性肝損傷的保護作用[J].食品科學，2014，35（13）：262-265.

[17] BHUSHAN B，CHAVAN HK，APTE U，et al. Dual role of epidermal growth factor receptor in liver injury and regeneration after acetaminophen overdose in mice[J]. Toxicol Sci，2017，155（2）：363-378.

（收稿日期：2018-05-07 修回日期：2018-07-08）

（編輯：林 靜）