CNAS T0781藥品的無菌檢查（薄膜過濾法）能力驗證結果與分析

北京市藥品檢驗所 中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室（102206）江志杰 張光華 劉文杰 高春

能力驗證是利用實驗室間比對測試來判定實驗室和檢查機構能力的活動[1]。它是實驗室的重要的外部質量保證手段，能增加客戶及相關方對實驗室出具可靠數據的信心[2]。根據《中國藥典》2010年版的要求，對要求無菌的藥品必須進行無菌檢查，而不同單位的無菌檢測能力各不相同或是檢驗環境的差異，可能會出現同一樣品出具不同的結果，因此開展藥品無菌檢測能力驗證來衡量檢測實驗室結果準確性具有重要意義，也為有效控制無菌藥品的結果準確性提供了技術的保障。為評價參加實驗室檢測藥品無菌的技術水平和能力，確定和核查實驗室對于本項目的檢測能力，提高各參加實驗室對該類測試項目的檢測水平，促進實驗室質量管理體系的進一步完善，因此開展本次能力驗證計劃。此能力驗證屬國內首次組織開展，出于保密需要，本次計劃對每個參加實驗室隨機賦予一個唯一的代碼(001～084)，在說明與參加實驗室有關的檢測結果和結果評價時，均以上述代碼表示實驗室。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備 HFsafe-1500 生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）、生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、XG1高壓蒸汽滅菌器（山東新華醫療器械股份有限公司）、HEY-SZ18068無菌隔離器（杭州泰林生物技術設備有限公司）等。

1.2 菌液的制備 根據《中國藥典》2015年版1101無菌檢查法項下要求制成黑曲霉濃孢子液（含孢子數105cfu/ml），置冰箱儲存，備用。取枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]斜面新鮮培養物加0.9%氯化鈉溶液將菌苔洗下，制成懸液，用吸管將懸液吸出至營養瓊脂大斜面（克氏瓶）上，均勻攤布，置33℃培養7d，進行革蘭氏染色觀察，確保芽孢含量在85%以上，用滅菌水50ml少量多次洗下孢子，合并洗液至大試管中，制成濃孢子液（含孢子數105cfu/ml），置冰箱儲存，備用。

1.3 能力驗證樣品的制備 樣品為XX藥業生產的注射用泮托拉唑鈉批號為17030811共1500支，分為300份，每份由A、B、C、D、E 5支樣品組成，其中三支樣品為無菌的注射用泮托拉唑鈉，一支樣品人工污染1μl上述細菌（枯草芽孢桿菌）菌液，一支樣品人工污染1μl上述真菌（黑曲霉）菌液。

1.4 方法學考察 根據《中國藥典》2015年版1101無菌檢查法項下要求，以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉為驗證菌，進行方法學驗證。

1.5 樣品穩定性和均勻性考察 按CANSGL03:2006[3]的要求，從樣品總體中隨機抽取20份樣品用于均勻性檢驗，采用已驗證的薄膜過濾法進行無菌檢查；不同的溫度（4℃、25℃、36℃）不同的時間點（15天、30天、60天）隨機取10份采用上述已驗證的薄膜過濾法進行無菌檢查，考察樣品的穩定性。

1.6 結果評價原則 3支無菌樣品和2支有菌樣品的檢驗結果均正確，即與預期結果完全一致，判定為滿意結果；2支有菌樣品中，任意1支檢驗結果出現錯誤，或3支無菌樣品中，任意1支檢驗結果錯誤，即為不滿意結果。

2 結果與分析

2.1 方法學驗證結果 本品與培養基會形成乳白色沉淀，故采用薄膜過濾法，用0.1%蛋白胨水溶液300ml沖洗一次，與對照管比較，含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計。故確定的檢驗方法如下：取本品1支，用0.9%氯化鈉注射液5ml溶解后，全量轉移至0.9%氯化鈉注射液100ml中，采用全封閉無菌試驗過濾培養器（三聯）全部過濾，用0.1%蛋白胨水300ml沖洗1次，每筒沖洗100ml，將胰酪大豆胨液體培養基100ml加入其中一筒，置25℃培養14天；其余兩筒均加入硫乙醇酸鹽流體培養基100ml，其中一筒加金黃色葡萄球菌作為陽性對照，置33℃培養14天，逐日觀察。

2.2 樣品均勻性和穩定性考察結果 從實驗結果得知，0時的無菌樣品均無菌生長，與已知結果（應無菌生長）一致；有菌樣品均有菌生長，與已知結果（應有菌生長）一致；此外，無菌的樣品分別在4℃、25℃、36℃不同的時間點取樣采用薄膜過濾法進行無菌檢查，結果均無菌生長；有菌的樣品分別在4℃、25℃、36℃不同的時間點取樣采用薄膜過濾法進行無菌檢查，結果顯示均有菌生長，作為定性樣品，符合均勻性和穩定性的要求。

2.3 能力驗證結果 本次能力驗證共有84家實驗室參加，全部提交了檢測報告，其中結果不滿意有8家，從不滿意結果的檢查報告中顯示，假陽性和假陰性結果均存在，具體結果見附表。

2.4 不滿意結果原因分析 通過對實驗室提供的檢測報告的核查，對可能造成上述8家不滿意結果的原因分析如下。

①無菌檢查試驗環境監控不到位，試驗人員無菌操作意識不夠強。CNAS T0781-058實驗室兩支陰性樣品均報“檢出”，可能是由于該實驗室無菌檢查環境不符合要求，操作人員的無菌操作意識不夠強而導致的。從其原始記錄中還發現，該兩瓶陰性樣品中檢出的菌均為革蘭氏陽性菌。CNAS T0781-037實驗室中的一支陰性樣品報“檢出”，從其原始記錄中發現，所有上報有菌生長的樣品均為第一天就生長，而含黑曲霉的陽性樣品，至少需要培養48小時以上才能觀察到有菌生長，即含黑曲霉的陽性樣品第一天生長的菌并非是黑曲霉，而是實驗過程中污染的微生物，故分析可能該實驗室無菌檢查環境不符合要求或操作人員的無菌操作意識不夠強所致。建議對檢出菌進行鑒定溯源，查找原因。

②培養基的質量不佳導致結果出現偏差。含枯草芽孢桿菌的陽性樣品在硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基中培養三天后均應生長良好，而CNAS T0781-017實驗室和CNAS T0781-062實驗室的含枯草芽孢桿菌的陽性樣品在改良馬丁中未生長，CNAS T0781-008實驗室是在第五天才發現有菌生長，可能是該實驗室的培養基的質量或滅菌條件不合適導致培養基營養有所下降所致，靈敏度可能不符合藥典要求，從而影響枯草芽孢桿菌和黑曲霉在改良馬丁培養基中生長速度或檢出率。從CNAS T0781-017實驗室提供的培養基適用性檢查記錄中可以發現，營養瓊脂接觸碟和營養瓊脂培養基的回收率最高才80%，有的僅為70.3%，盡管符合藥典要求（大于70%），但其靈敏度已有所下降，且培養基開啟日期為2013年11月20日，時間較長，可能影響其培養基質量，從而導致檢驗結果出現偏差。

③試驗記錄可能有誤，結果出現混淆。CNAS T0781-011實驗室一支陽性樣品B（黑曲霉），上報結果為“未檢出”；一支陰性樣品D，上報結果為“檢出”。通過原始記錄分析發現，其報檢出的陰性樣品D僅改良馬丁培養基中有菌生長，且是第三天開始生長，與黑曲霉的生長特性相吻合，是在試驗或記錄過程中將樣品D與樣品B混淆所致。

3 結論

CNAS 在CNAS RL02:2011中規定了實驗室應將能力驗證作為重要的外部質量評價活動，對參加了CNAS 組織及其承認的能力驗證活動且有穩定滿意表現的機構，在CNAS 的各類評審中可根據情況簡化相關項目的能力確認過程[4]。能力驗證工作的重要性已得到社會各界的廣泛認可，鼓勵更多的實驗室參加各種能力驗證活動，可以提高我國藥品檢測質量控制整體水平和實驗室的技術能力。通過本次能力驗證，發現許多實驗室從環境、人員、操作SOP、培養基等許多地方需要改進，為避免實驗結果出現假陽性和假陰性，筆者建議加強對檢驗人員的技術培訓，熟悉無菌檢測的檢驗方法，嚴格把握檢測過程中的關鍵控制點和無菌意識；加強對培養基質量的控制，對每一批培養基應進行適用性檢查，同時對消毒過程要嚴格監控，防止消毒不徹底或溫度過高等，并做好記錄，對放置時間太久已開啟的干粉培養基，盡量不要使用，以免影響其質量；對實驗過程中的環境進行監控，對環境中收集的菌進行染色、分離、純化、鑒定，建立實驗室的菌種庫，將樣品中分離的菌與環境中分離的菌進行溯源分析，進行同源性比較，采用多種方法對可疑結果進行判定。

附表 8家不滿意實驗室上報的具體結果