對胚胎工程中幾個(gè)疑難問題的解釋

張計(jì)輝

[摘 要]在學(xué)習(xí)《現(xiàn)代生物科技專題》胚胎工程內(nèi)容的過程中，學(xué)生常會(huì)遇到較多的疑難問題。基于此，針對胚胎工程中的精子獲能培養(yǎng)液成分、胚胎的冷凍保存、母牛是否妊娠的檢查及飼養(yǎng)層細(xì)胞的有關(guān)疑難問題做進(jìn)一步的解釋，以幫助學(xué)生有效突破學(xué)習(xí)難點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞]胚胎工程；疑難問題；精子獲能；冷凍保存；妊娠檢查；飼養(yǎng)層細(xì)胞

[中圖分類號(hào)] G633.91 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-6058（2018）20-0096-01

在《現(xiàn)代生物科技專題》之“胚胎工程”的學(xué)習(xí)中，有些內(nèi)容較難理解，但教材只給出了實(shí)際的應(yīng)用情況，對其原理并沒有做進(jìn)一步闡述，使學(xué)生產(chǎn)生疑問。本文就胚胎工程中的幾個(gè)疑難問題進(jìn)行了解釋。

疑問1：精子為什么要獲能？人工配制的獲能液的主要成分是什么？化學(xué)培養(yǎng)法中為何要加入肝素或Ca2+離子載體？

精子獲能的原理：成熟的精子本身具有受精能力，但由附睪分泌的物質(zhì)附于精子表面（稱為質(zhì)膜），阻止了頂體酶的釋放。精子獲能是指精子質(zhì)膜表面的糖蛋白被降解，同時(shí)質(zhì)膜中膽固醇的量發(fā)生變化，質(zhì)膜穩(wěn)定性降低，頂體酶得以釋放的過程。因此精子需要獲能。

人工配制的獲能液的成分：TYH精子獲能液是為精子所配備的碳酸氫鹽緩沖液，可在預(yù)備受精時(shí)滿足精子獲能的各種需要。組分主要有NaCl、KCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NaHCO[-3]、CaCl2、丙酮酸鈉、甲基-β-環(huán)糊精等。高濃度的HCO[-3]能夠使質(zhì)膜表面均勻分布的膽固醇集中到精子頭部頂端，甲基-β-環(huán)糊精能夠移去質(zhì)膜上的膽固醇，從而破壞質(zhì)膜的完整性，丙酮酸鈉則作為能量的來源。

化學(xué)培養(yǎng)法中添加物質(zhì)的作用：肝素是硫酸化程度最高的氨基多糖。氨基多糖可通過結(jié)合和去除精子質(zhì)膜上抑制獲能的蛋白來刺激獲能。“A23187”載體是一種移動(dòng)性離子載體，加入到含有Ca2+的細(xì)胞培養(yǎng)液中，則Ca2+很快進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，Ca2+濃度升高可誘導(dǎo)頂體酶的活性。

疑問2：細(xì)胞在-196℃液氮中保存，細(xì)胞不會(huì)被凍死嗎？

細(xì)胞被冷凍的過程可分為液晶態(tài)和玻璃態(tài)兩種狀態(tài)，由前者進(jìn)入后者。目前，細(xì)胞凍存最常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護(hù)劑的緩慢冷凍法凍存細(xì)胞。

細(xì)胞在不加保護(hù)劑的情況下直接冷凍，細(xì)胞內(nèi)外的水分會(huì)很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應(yīng)，如細(xì)胞脫水使局部電解質(zhì)濃度增高，pH值改變；部分蛋白質(zhì)變性，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)成分遭到破壞；線粒體腫脹，功能丟失，并造成能量代謝障礙，細(xì)胞核DNA空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷，而致細(xì)胞死亡；等等。因此，細(xì)胞冷凍技術(shù)的關(guān)鍵是盡可能地減少細(xì)胞內(nèi)水分，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。

采用甘油或二甲基亞砜做保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對水的通透性，且對細(xì)胞無明顯毒性。緩慢冷凍法又可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少胞內(nèi)形成冰結(jié)晶的機(jī)會(huì)，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。因此，胚胎在 -196℃液氮中保存可以不被凍死。

疑問3：如何進(jìn)行受體母牛的妊娠檢查？

對母牛進(jìn)行妊娠檢查常用的方法有直腸檢測法、陰道檢查法、激素診斷法、看“眼線”法等，均在配種后25～30天后進(jìn)行檢查。課本圖示的方法為直腸檢測法。

直腸檢測法：通過直腸內(nèi)壁觸摸卵巢上的黃體變化及子宮的變化來判斷奶牛是否妊娠。母牛配種后30天檢查，此時(shí)排卵側(cè)卵巢體積增大到原來的1倍，同核桃大甚至雞蛋大，質(zhì)地較硬，黃體明顯凸出于卵巢表面，而另一側(cè)卵巢無變化；子宮角大于空角，增粗、質(zhì)地松軟，有波動(dòng)感，觸摸時(shí)無收縮反應(yīng)，可判定為妊娠。陰道檢查法：陰道黏膜蒼白，無光澤；子宮頸口偏向一側(cè)，呈閉鎖狀態(tài)，被灰暗濃稠的黏液所封閉。激素診斷法：用乙烯雌酚10 mg，一次肌肉注射。已妊娠者無發(fā)情表現(xiàn)；未妊娠者第2天便表現(xiàn)出明顯發(fā)情。看“眼線”法：在瞳孔的正下方鞏膜表面，有明顯的縱向血管1～2條（個(gè)別也有3條的），呈直線狀態(tài)，顏色深紅，輪廓清晰，又沒有任何發(fā)情表現(xiàn)，則為妊娠。

疑問4：什么是飼養(yǎng)層細(xì)胞？為什么它能夠使細(xì)胞分裂而不分化？

飼養(yǎng)層細(xì)胞是經(jīng)過射線照射或絲裂霉素C（有絲分裂阻斷劑）處理后，用作克隆細(xì)胞附著底物且能產(chǎn)生多種營養(yǎng)因子的細(xì)胞。常見的飼養(yǎng)層細(xì)胞有顆粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞等，飼養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)有絲分裂阻斷劑處理后雖然失去了分裂能力，但仍然保持生存能力。

在細(xì)胞體外培養(yǎng)中，先培養(yǎng)一層飼養(yǎng)層細(xì)胞，然后在其上接種要實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞，這樣更能模擬體內(nèi)環(huán)境。飼養(yǎng)層細(xì)胞可為所培養(yǎng)的細(xì)胞提供它們在體外存活增殖所必需的生長因子，還會(huì)產(chǎn)生能抑制細(xì)胞自發(fā)性分化的多肽細(xì)胞因子，所以飼養(yǎng)層細(xì)胞可以使培養(yǎng)的細(xì)胞保持分裂而不分化的狀態(tài)。

（責(zé)任編輯 黃春香）