淋巴細(xì)胞免疫治療對(duì)反復(fù)妊娠流產(chǎn)患者封閉抗體表達(dá)的影響及其臨床意義

陳偉才　李琳　何金勇　孔瑩

【摘要】 目的：探究淋巴細(xì)胞免疫治療對(duì)反復(fù)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）患者封閉抗體（blocking anti-bodies，BA）的表達(dá)影響及其臨床意義。方法：選取2015年1月-2016年1月本院確診為RSA患者269例，均行淋巴細(xì)胞免疫療法。檢測(cè)患者治療前后外周血BA表達(dá)、免疫球蛋白濃度、淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量及相關(guān)比值，患者治療后均隨訪1年，記錄隨訪期間患者妊娠情況。結(jié)果：治療前BA陽性24例（8.92%），低于治療后的225例（83.64%），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（字2=324.51，P=0.000）；治療后IgA、IgM、IgG水平均低于治療前（P<0.05）；且治療后，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均低于治療前，CD8+高于治療前，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；BA陽性孕婦妊娠成功率為92.18%（165/179），明顯高于BA陰性孕婦的60.00%（3/5），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=6.344，P=0.012）。結(jié)論：淋巴細(xì)胞免疫治療RSA有助于提高患者BA表達(dá)，調(diào)節(jié)患者免疫水平并增加妊娠成功率。

【關(guān)鍵詞】 淋巴細(xì)胞免疫療法； 反復(fù)性流產(chǎn)； 封閉抗體； 淋巴細(xì)胞亞群

【Abstract】 Objective：To explore the effect of lymphocyte immunotherapy on the expression of blocking anti-bodies（BA） in patients with recurrent spontaneous abortion（RSA） and its clinical significance.Method：A total of 269 patients with RSA diagnosed in our hospital from January 2015 to January 2016 were selected，they were treated with lymphocyte immunotherapy.The expression of BA，the concentration of immunoglobulin，the number of lymphocyte subsets and the relative ratio were measured before and after treatment，they were followed up for 1 year after treatment，and the pregnancy was recorded during the follow-up period.Result：Before treatment，BA positive was 24 cases（8.92%），lower than 225 cases（83.64%） of after treatment，the difference was statistically significant（字2=324.51，P=0.000）.After treatment，the levels of IgA，IgM and IgG were all lower than those of before treatment（P<0.05）.After treatment，CD3+，CD4+ and CD4+/CD8+ were all lower than those of before treatment，CD8+ was higher than that of before treatment，the differences were statistically significant（P<0.05）.The pregnancy rate of BA positive pregnant women was 92.18%（165/179），which was significantly higher than 60.00%（3/5） in BA negative pregnant women，the difference was statistically significant（字2=6.344，P=0.012）.Conclusion：Lymphocyte immunotherapy in treatment of RSA can help improve BA expression，regulate immune function and increase pregnancy success rate.

【Key words】 Lymphocyte immunotherapy； Recurrent spontaneous abortion； Blocking anti-bodies； Lymphocyte subsets

First-authors address：Shunde Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)oshan 528333，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.21.016

反復(fù)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指同一婦女連續(xù)發(fā)生3次及以上的自然流產(chǎn)，其發(fā)病率在育齡期女性中為1%～3%[1]，RSA發(fā)病與患者內(nèi)分泌、生殖道異常、遺傳因素等多個(gè)方面均有關(guān)聯(lián)，但具體發(fā)病病因尚未闡明[2]。妊娠過程中，胚胎作為一種同種異體移植物被母體識(shí)別，正常情況下母體會(huì)產(chǎn)生封閉抗體（blocking anti-bodies，BA）以降低自身免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎的攻擊[3]，但研究發(fā)現(xiàn)，40%～65%的患者存在不同程度的BA分泌缺陷導(dǎo)致發(fā)病[4]。而淋巴免疫治療是通過將患者丈夫或第三健康人的外周血中淋巴細(xì)胞注入患者皮下，進(jìn)而產(chǎn)生類似于BA的IgG以達(dá)到保護(hù)胚胎，持續(xù)妊娠的作用[5]，但其療效仍存在很大的爭(zhēng)議，現(xiàn)筆者通過分析行淋巴細(xì)胞免疫治療的反復(fù)流產(chǎn)患者治療前后BA產(chǎn)生情況，以及患者體內(nèi)免疫因子水平變化，以期為淋巴細(xì)胞免疫治療的推廣提供數(shù)據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月-2016年1月本院確診為RSA患者269例。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)歷3次或3次以上不明原因流產(chǎn)；②夫妻雙方染色體核型分析均正常；③血型和抗體為母胎ABO不相容；④丈夫精液常規(guī)檢查正常，抗精子抗體陰性；⑤患者凝血功能正常；⑥TORCH 4項(xiàng)（風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒、弓形體、巨細(xì)胞病毒）陰性；

⑦抗心磷脂抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體、抗卵巢抗體、抗絨毛膜促性腺激素抗體、抗透明帶抗體、抗滋養(yǎng)細(xì)胞層抗體、抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體均呈陰性。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：近親婚配；有吸煙、酗酒、吸毒等不良習(xí)慣；存在生殖器異常或病變。269例患者年齡21～37歲，平均（27.89±3.47）歲；孕次3～5次，平均（4.10±0.85）次。患者均行淋巴細(xì)胞免疫療法，患者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 淋巴細(xì)胞免疫治療方法 首選患者配偶進(jìn)行淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫測(cè)試，如果存在梅毒螺旋體、艾滋病及肝炎病毒等疾病則采用健康第三者的淋巴細(xì)胞進(jìn)行治療。抽取外周血30 mL，分離淋巴細(xì)胞制成懸浮液，抽取0.3 mL淋巴細(xì)胞懸液注射于患者前臂近腋窩分5～8點(diǎn)進(jìn)行皮內(nèi)注射，皮丘直徑0.5 cm左右，每2～4周1次，左右臂交替，4次為一療程。療程結(jié)束后復(fù)查BA，若轉(zhuǎn)為陽性則指導(dǎo)受孕；若BA陰性則進(jìn)行第2個(gè)療程的治療，以此類推。若

3個(gè)療程后BA仍陰性者剔除出本研究。對(duì)BA轉(zhuǎn)陽者立即指導(dǎo)受孕，并每2～3個(gè)月進(jìn)行1次維持治療，妊娠后每1～2個(gè)月進(jìn)行1次治療，直至妊娠12周或超聲顯示胎盤形成良好。治療后均隨訪1年，記錄隨訪期間患者妊娠情況。

1.3 觀察指標(biāo) （1）BA：每個(gè)治療療程前后，抽取患者排卵期間抽取晨起空腹靜脈血5 mL，高速離心后取上清液，采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，具體操作步驟按照所購買的試劑盒進(jìn)行操作（BAELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。（2）IgA、IgM、IgG表達(dá)水平：治療前后，抽取患者排卵期間抽取晨起空腹靜脈血5 mL，高速離心后取上清液，采用放射比濁法檢測(cè)IgA、IgM、IgG表達(dá)水平，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作（IgA、IgG和IgM試劑及校準(zhǔn)品均購自美國(guó)Beckman公司）。（3）淋巴細(xì)胞亞群水平：治療前后，抽取患者排卵期間抽取晨起空腹靜脈血5 mL，采用流式細(xì)胞儀（CytoFLEX流式細(xì)胞儀購自美國(guó)Beckman有限公司）進(jìn)行分析，計(jì)算其中CD4+、CD3+、CD8+淋巴細(xì)胞相對(duì)數(shù)目以及CD4+/CD8+。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 18.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者治療前后BA陽性表達(dá)情況比較 治療前BA陽性24例（8.92%），低于治療后的225例（83.64%），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=324.51，P=0.000）。其中淋巴細(xì)胞免疫治療1個(gè)療程時(shí)，BA陽性率43.49%（117/269）；共有152例患者進(jìn)行淋巴細(xì)胞免疫治療2個(gè)療程，BA陽性率為44.74%（68/152）；共84例進(jìn)入淋巴細(xì)胞免疫治療3個(gè)療程時(shí)，BA陽性率為47.62%（40/84）。

2.2 患者治療前后IgA、IgM、IgG水平比較 淋巴細(xì)胞免疫治療后IgA、IgM、IgG水平均低于治療前（P<0.05），見表1。

2.3 患者治療前后淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)比較 治療后，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均低于治療前，CD8+高于治療前，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.4 患者治療后隨訪1年的情況 269例患者中妊娠184例，妊娠率為68.40%，其中BA陽性妊娠179例，BA陰性妊娠5例。BA陽性225例中，

179例妊娠，妊娠率為79.56%，其中154例已足月分娩，11例已孕12周以上，14例自然流產(chǎn)，自然流產(chǎn)率為7.82%；BA陰性44例，5例妊娠，妊娠率為11.36%，其中2例已足月分娩，1例已孕12周以上，2例自然流產(chǎn)，自然流產(chǎn)率為40.00%。BA陽性孕婦妊娠成功率為92.18%（165/179），明顯高于BA陰性孕婦的60.00%（3/5），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=6.344，P=0.012）。

3 討論

自然流產(chǎn)占妊娠總數(shù)的15%左右，其中3次或3次以上自然流產(chǎn)即RSA，其發(fā)病率為1%～3%[6]，但RSA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，除了遺傳、解剖、內(nèi)分泌、感染等因素后，仍有40%～80%的病例發(fā)病原因不明[7-8]。目前臨床認(rèn)為，母體免疫系統(tǒng)將胚胎視為外來物進(jìn)行攻擊導(dǎo)致的流產(chǎn)為主要因素[9]，BA是由機(jī)體白細(xì)胞抗原（HLA）、滋養(yǎng)層及淋巴細(xì)胞交叉反應(yīng)抗原等刺激母體免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生的一類抗體[10]，胚胎攜帶來源于父系的多態(tài)基因，作為半抗原可激活母體免疫應(yīng)答[11]，但在正常情況下，母體的免疫系統(tǒng)對(duì)于胎兒的同種免疫反應(yīng)受到了抑制，多種免疫因素通過有機(jī)協(xié)調(diào)達(dá)到母胎間的免疫平衡，避免胚胎受到免疫排斥[12-13]，使得妊娠得以進(jìn)行。一旦這種平衡狀態(tài)被打破，胚胎極易受到母體免疫攻擊而發(fā)生流產(chǎn)[14]。

而淋巴細(xì)胞免疫治療是采用配偶或無關(guān)個(gè)體的淋巴細(xì)胞在患者前臂等處進(jìn)行皮下注射，導(dǎo)母體產(chǎn)生同種免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生相應(yīng)的BA[15-16]，以及微淋巴細(xì)胞毒抗體，降低母體免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎的免疫排斥反應(yīng)[17]，使得患者妊娠能夠繼續(xù)，本研究結(jié)果顯示，治療前BA陽性24例（8.92%），低于治療后的225例（83.64%），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示該方法對(duì)于大部分反復(fù)流產(chǎn)的患者可有效誘導(dǎo)BA增加，但仍有少數(shù)患者無法產(chǎn)生BA，其中具體原因仍不清楚。其中淋巴細(xì)胞免疫治療每個(gè)療程出現(xiàn)BA陽性的概率在40%～50%，這與患者個(gè)體實(shí)際情況有關(guān)。

此外研究結(jié)果顯示，治療后IgA、IgM、IgG水平均低于治療前（P<0.05）；且治療后，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均低于治療前，CD8+高于治療前，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說明淋巴細(xì)胞免疫治療對(duì)患者的免疫系統(tǒng)出現(xiàn)了一定的調(diào)整，研究發(fā)現(xiàn)女性子宮內(nèi)膜中T淋巴細(xì)胞主要以CD8+為主[18]，CD8+細(xì)胞可分化為Tc2細(xì)胞分泌Th2有助于妊娠過程[19]，并抑制B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫與抑制CD4+細(xì)胞介導(dǎo)的超敏反應(yīng)[20]，淋巴治療后CD8+水平上升，有助于患者提高妊娠成功率。IgA、IgM、IgG水平的降低，說明了免疫淋巴細(xì)胞治療除了提高BA抗體數(shù)目，還可輕微抑制患者免疫系統(tǒng)，降低免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎的殺傷風(fēng)險(xiǎn)。

隨訪發(fā)現(xiàn)，269例患者中妊娠184例，妊娠率為68.40%，其中BA陽性妊娠179例，BA陰性妊娠5例；BA陽性孕婦妊娠成功率為92.18%（165/179），明顯高于BA陰性孕婦的60.00%（3/5），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說明免疫淋巴細(xì)胞治療可有效提高患者妊娠成功率。

綜上所述，淋巴細(xì)胞免疫治療RSA有助于提高患者BA表達(dá)，調(diào)節(jié)患者免疫水平并增加妊娠成功率。

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（收稿日期：2018-04-24） （本文編輯：董悅）