煙草綠原酸生物合成途徑關鍵酶基因的研究進展

楊銀菊 陳愛國 劉光亮 張彥 王樹聲

摘要 綠原酸是重要的植物苯丙素類次生代謝產物之一，與植物的食品風味和藥用生物活性等密切相關，其生物合成與調控研究一直是科研人員所關注的焦點。本文綜述了煙草綠原酸生物合成途徑中關鍵節點苯丙氨酸解氨酶基因、肉桂酸-4-羥化酶基因、對-香豆酸輔酶A連接酶基因、羥基肉桂酰輔酶A：奎尼酸羥基肉桂酰轉移酶基因、羥基肉桂酰輔酶A莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉移酶基因、對-香豆酸3′-羥化酶基因的研究進展，并進一步展望了煙草綠原酸生物合成代謝調控的研究方向，旨在為煙草綠原酸生物合成途徑的深入研究和定向調控提供參考。

關鍵詞 煙草；綠原酸；生物合成；關鍵酶；基因

中圖分類號 S572 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）13-0005-04

Research Progress on Key Enzyme Genes in Chlorogenic Acid Biosynthesis Pathway

YANG Yin-ju 1，2，3 CHEN Ai-guo 1，2 LIU Guang-liang 1，2 ZHANG Yan 1，2 WANG Shu-sheng 1，2 *

（1 Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Qingdao Shandong 266101； 2 Key Laboratory of Tobacco Biology and Processing，Ministry of Agriculture； 3 Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences）

Abstract Chlorogenic acid is one of the important phenylpropanoids formed by plants secondary metabolism，which is closely related to plant food flavor and medical biological activity. Accordingly，the researches on the chlorogenic acid biosynthetic pathway and its regulation have been the focus of researchers.In this paper，considering the biosynthesis pathway of tobacco chlorogenic acid，we described the molecular regulations of the key nodes containing phenylalanine ammonia-lyase gene，cinnamic acid 4-hydroxylase gene，4-coumarate-CoA ligase gene，Hydroxycinnamoyl-CoA：quinate hydroxycinnamoyl transferase gene，hydroxycinnamoyl CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransferase gene，and ρ-coumaroylester 3′-hydroxylases gene.Additionally，the future researches on metabolic regulation of tobacco chlorogenic acid biosynthesis were further prospected，in order to provide reference for better understand the biosynthetic mechanism of tobacco chlorogenic acid and its regulation.

Key words tobacco；chlorogenic acid；biosynthesis；key enzyme；gene

綠原酸（chlorogenic acid，CGA）在植物界中廣泛存在，主要分布于忍冬科、菊科、杜仲科和茄科[1]。煙草（Nicotiana tabacum L.）是茄科煙草屬植物，其綠原酸含量可達3%[2]，相對較高。煙草中，綠原酸除了本身具有清香風味之外，還可以在多酚氧化酶等的作用下生成吡嗪、吡啶、吡咯類等有堅果香物質[3]，賦予煙草制品優雅的香氣，增加煙草制品的香氣量。此外，綠原酸分子含有不飽和雙鍵、酯鍵與多元酚等，是重要的天然抗氧化劑，與植物細胞對低溫、紫外線以及病害等非生物和生物抗性密切相關[1，4]。因此，研究煙草中綠原酸的生物合成與積累對提高煙草品質和抗逆性具有重要意義。目前，煙草中的綠原酸生物合成途徑及其關鍵酶基因研究主要集中在酶活性與煙株抗逆活動之間的關系，而對該途徑中關鍵基因的特征和功能及其與烤煙品質形成關系研究較少。因此，本文綜述了煙草綠原酸生物合成途徑及其關鍵酶基因的研究進展，為定向調控煙草中綠原酸的生物合成從而改善烤煙品質提供參考。

1 煙草綠原酸生物合成途徑

綠原酸是咖啡酸與奎尼酸的反應產物。煙草中，綠原酸主要在葉片中合成[5]。目前，普遍認為綠原酸的生物合成主要有2條途徑：一是HQT催化咖啡酰輔酶A和奎尼酸通過酯交換合成綠原酸[6]（圖1，Ⅰ）；二是咖啡酰苷作物活性中間體與奎寧酸酯交換生產綠原酸[7]（圖1，Ⅱ）。也有報道認為，存在第3條可能的途徑，即在HCT的催化下生成對-香豆酰奎尼酸，隨后經C3H羥基化作用生成綠原酸[1]（圖1，Ⅲ）；然而，在擬南芥中HCT和C3H均有活性時，并不積累綠原酸，使得綠原酸的該生物合成途徑是否存在受到質疑[1]。

2 煙草綠原酸生物合成關鍵酶基因

2.1 苯丙氨酸解氨酶基因

苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）是苯丙烷代謝途徑的第一個關鍵酶，催化苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸（圖1），是連接初生代謝和次生代謝的關鍵酶（表1）。因此，PAL在植物生長發育、應激防御中起關鍵作用。許多涉及苯丙烷途徑的應激反應可以誘導PAL活性。本課題組研究表明，4 ℃低溫處理后，烤煙品種K326和紅花大金元PAL活性分別增加163.95%和159.39%；NaCl脅迫處理后K326和紅花大金元PAL分別增加126.29%和129.24%，增強了紅花大金元材料中隱綠原酸合成代謝及K326材料中綠原酸合成代謝[8]。光照也可刺激PAL活性；遮蔭可以抑制PAL的活性，白光處理后 PAL活性遠大于其他光質處理，藍光處理明顯降低了PAL活性[9]。PAL基因在響應生物和非生物脅迫如機械損傷、低溫、病原物侵染、缺素和信號物質（茉莉酸、水楊酸、脫落酸）處理時主要受轉錄水平調控[10]。法國豆的3個PAL基因的轉錄水平均受機械損傷誘導[11]。

在植物中，苯丙氨酸解氨酶是多基因家族編碼的。例如，楊樹[12]PtrPAL基因家族由5個成員（PtrPAL1-5）組成，黃瓜[13]PAL家族有7個成員，番茄[14]PAL數目多達26個，擬南芥[15]和煙草中均有4個PAL基因。煙草的4個PAL基因分成2個亞家族，NtPAL1和NtPAL4為一個亞家族，NtPAL2和NtPAL3為一個亞家族，并且這4個基因在根、莖、葉、花中均有表達，其中NtPAL4在雄蕊、木質部和根中表達量較高，但在莖、髓組織中幾乎檢測不到；除木質部和葉片外，所有組織中的NtPAL2轉錄水平均低于NtPAL1和NtPAL3；大多數NtPAL在成熟葉和髓中表達水平較低[11]。

2.2 肉桂酸-4-羥化酶基因

肉桂酸-4-羥化酶（cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H），屬于細胞色素P450單加氧酶CYP73家族，催化肉桂酸生成香豆酸。C4H的表達和活性受光線、病原物和機械損傷等諸多因素的調控[16]，研究表明，適度遮蔭有利于提高K326和紅花大金元的C4H活性，遮蔭程度較高時（44%自然光），2個品種C4H活性均受到抑制[9]。4 ℃低溫處理后，K326和紅花大金元C4H活性分別增加218.83%和189.36%。此外，NaCl處理也能提高C4H活性[8]。

C4H主要參與木質素生物合成。桉樹C4H表達下調木質素含量降低[17]。在苜蓿中，C4H表達下調的植株不僅木質素含量降低，而且S/G比值也降低[18]。煙草C4H表達下調也表現出相似的現象[19]。青蒿C4H基因沉默植株反式肉桂酸積累，香豆酸、總酚、花青素、C4H和PAL活性降低[20]。Huang等[21]研究表明，防御/應激途徑的信號成分子如茉莉酸甲酯（MJ）、脫落酸（ABA）和紫外線B輻射（UV-B）可刺激丹參SmC4H轉錄水平上調。

C4H已在普通煙草中得到克隆，本課題組[22]克隆得到了K326和紅花大金元烤煙品種NtC4H1和NtC4H2基因的全長cDNA序列，開放閱讀框均為1 518 bp，編碼505個氨基酸（表1）。并且發現NtC4H1和NtC4H2在2個品種中表達模式存在差異。

2.3 4-香豆酸輔酶A連接酶基因

4-香豆酸輔酶A連接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL），催化對香豆酸生成對香豆酰輔酶A。除了對香豆酸之外，4CL異構體能夠利用多種羥基肉桂酸衍生物作為底物，例如4CL可以催化咖啡酸生成咖啡酸輔酶A，以阿魏酸作為底物生成阿魏酰輔酶A。由于4CL處于初級苯丙烷代謝的終端位置以及能夠利用多種相關底物，因而4CL在碳源流入苯丙烷代謝的特定分支起關鍵作用[23]。

4CL以基因家族的形式存在，在擬南芥中編碼4CL酶的基因有3個，即At4CL1、At4CL2和At4CL3[24]。而在普通煙草中則由Nt4CL1和Nt4CL2 這2個基因編碼4CL[25]。系統進化樹分析表明，4CL基因通常被分為2個不同的基因簇（Class Ⅰ和Class Ⅱ），它們在單子葉植物和雙子葉植物中具有不同的生理功能[26]。Class Ⅰ 4CLs參與木質素和其他結構相關的苯丙素衍生物的生物合成，而Class Ⅱ 4CLs參與類黃酮生物合成[27-28]。Class Ⅰ 4CLs表達模式在不同物種木質化區域基本一致。例如，擬南芥[29]At4CL1和At4CL2主要局限于維管束組織，白楊[30] Pt4CL1主要在木質部中表達。通過檢測mRNA的積累和啟動子活性發現馬鈴薯（Solanum tubero-sum）[31]，煙草（Nicotiana tabacum）[32]和水稻（Oryza japonica）[33]Class Ⅰ 4CLs也具有相似的表達模式。Class Ⅱ 4CLs表達通常在花和非木質化組織。楊樹[30] Pt4CL2優先在葉和莖的表皮及花中表達。擬南芥花、成熟葉、長角果、莖和根中也已經檢測到At4CL3的表達[34]。

有研究表明，將4CL1基因轉入到煙草中，會抑制煙草內源4CL基因表達，使得4CL活性降低，4CL的代謝底物積累[35]。CaMV啟動子35S正義融合4CL1轉基因煙草葉片和莖4CL酶活性增加，木質素含量增加；sjGRP1.8正義融合4CL1轉基因煙草中葉片4CL酶活性未見增加，而莖4CL活性提高，葉片木質素含量與未轉基因植株沒有差異，而莖部木質素含量增加25%[36]。Pt4CL1正義轉基因煙草葉片及莖中酶活性和木質素含量分析也得到了相似的結果[37]。

本課題組[22]克隆得到K326和紅花大金元烤煙品種Nt4CL1和Nt4CL2全長cDNA序列，開放閱讀框（ORF）長度分別為1 644 bp和1 629 bp（表1）。同時研究發現，Nt4CL在木質部的表達高于韌皮部。在適熟期紅花大金元和K326， 4CL活性大小均表現為中部葉>下部葉>上部葉，這與Nt4CL1在不同組織中表達水平一致。

2.4 羥基肉桂酰輔酶A：奎尼酸羥基肉桂酰轉移酶基因

羥基肉桂酰輔酶A：奎尼酸羥基肉桂酰轉移酶（Hydrox-ycinnamoyl-CoA：quinate hydroxycinnamoyl transferase，HQT），是綠原酸生物合成最后一步的關鍵酶，催化咖啡酰輔酶A和奎尼酸進行酯交換生成CGA。HQT、HCT屬于BAHD超家族的一大類酰基-輔酶A-依賴的酰基轉移酶，具有酰基受體的特異性。研究發現，HQT基因與HCT基因是緊密連鎖的，并且HQT與HCT可以催化香豆酰莽草酸與香豆酰奎尼酸酯的生物合成[38]。HQT是綠原酸生物合成所必需的酶。在煙草植株中瞬時表達或在番茄中穩定轉化使HQT基因表達下調導致綠原酸含量顯著降低（在番茄中減少高達98%）。相反，煙草和番茄植株過表達HQT后綠原酸水平大幅提高[38]。利用高效液相色譜法（HPLC）測定咖啡綠原酸含量，結合RT-qPCR分析綠原酸合成關鍵酶基因HCT、HQT、C3H1和CCOAOMT1在不同組織中的表達量，結果表明，HQT高表達與綠原酸積累有關[39]。RNAi抑制HQT基因表達導致CGA減少90%和早花[40]。此外，該研究還表明，HQT和PAL之間存在一個調節回路，在HQT被抑制的路徑上觀察到PAL基因表達量下調和酶活性下降。Chang等[41]也有相關的報道，AtPAL2在煙草中過表達使綠原酸含量增加2倍，而在HQT沉默的AtPAL2過表達植株中綠原酸含量減少50%。

2.5 羥基肉桂酰輔酶A莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉移酶基因

羥基肉桂酰輔酶A莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉移酶（hydroxycinnamoyl CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltr-ansferase，HCT）是木質素單體生物合成途徑中的關鍵酶，催化香豆酰輔酶A（p-coumaroyl CoA）發生羥基化作用轉化成咖啡酰輔酶A（caffeoyl CoA），也是控制木質素H-單體轉化為G/S-單體的關鍵酶[42]。Hoffmann等[43]已從煙草中純化得到HCT，對其活性進行分析表明，該酶能夠催化莽草酸或奎尼酸與香豆酸和咖啡酸生成酯，對莽草酸的親和力更高。此外，還發現煙草HCT能催化綠原酸水解，形成咖啡酰輔酶A和奎寧酸。

到目前為止，已經相繼有擬南芥、煙草、番茄、桉樹、輻射松、洋姜和洋白菜等多個物種的HCT基因被克隆[38]。在朝鮮薊中，編碼HCT基因的cDNA已被分離得到[44]，同時發現HCT有助于綠原酸的生物合成。

HCT在植物中分布具有一定的組織特異性，在煙草中從莖、葉柄、根部、雄蕊、雌蕊、花瓣、幼葉到老葉其分布順序依次減少，而在擬南芥中，HCT在莖中分布較多，并且發現蛋白含量與基因表達緊密相關[42]。煙草HCT還可能參與綠原酸向咖啡酰輔酶A的再分配，因為煙草植株HCT沉默后綠原酸在莖桿中大量積累[45]。李 洋等[46]運用高效液相色譜（HPLC）檢測轉基因煙草植株綠原酸和類黃酮物質的含量變化，表明NtHCT基因不僅參與綠原酸合成的調控，而且正向調控類黃酮物質的生物合成。

2.6 對-香豆酸3′-羥化酶基因

對-香豆酸3′-羥化酶（ρ-coumaroylester 3′-hydroxylases， C3H）是綠原酸合成途徑中另一類關鍵酶，研究發現，這類酶是由細胞色素CYP98A編碼的[47]。當它被酯化為莽草酸或奎尼酸時可催化香豆酸的3位發生羥基化反應。C3H基因最早在擬南芥中被克隆。目前，已從擬南芥、銀杏、毛竹、火炬松、小麥、芝麻、楊樹等多種植物中成功克隆到C3H基因[38]。Schoch等[48]采用功能基因克隆的方法從擬南芥細胞色素P450中分離到CYP98A3基因，并證明CYP98A3是C3H，它主要在植物木質部中表達，是控制植物木質素合成代謝中的H單體轉為G/S單體的關鍵酶。Raes等[49]從擬南芥基因組中分離到3個C3H基因，發現只有一個基因（C3H1）在所有組織中表達，其他2個基因僅在特定發育階段的特定組織中表達。NtC3H基因參與煙草中類黃酮和綠原酸等次生代謝物質的合成。李 洋等[45]將NtC3H在煙草中過表達，發現轉基因煙草葉片中綠原酸及蘆丁含量分別提高了3.6倍和6.1倍，山奈酚蕓香苷含量提高了24.6倍。

3 展望

綠原酸具有廣泛的生理活性和藥理活性，在醫藥、食品、日用化工等行業具有廣闊的應用前景。因此，綠原酸合成代謝已經引起了廣大研究者的關注。特別是隨著分子生物學的發展，對綠原酸代謝通路的關鍵酶基因表達開展了大量的研究，并取得了巨大的進展，但目前仍然有許多問題有待進一步研究。盡管綠原酸生物合成途徑關鍵酶基因的啟動子調節表達模式已經在多個物種中報道，但有些啟動子的核心結構域和功能性順式作用元件尚未得到表征，還應進一步研究。不同的生物體、組織、發育階段和環境因子等多種因素均可影響綠原酸含量及其同分異構體組分比例。因此，如何通過現代生物技術改變關鍵因素來調控綠原酸的生物合成將成為研究熱點之一。催化綠原酸合成的關鍵酶大多為多基因編碼，采取多基因轉化策略是未來提高綠原酸合成和積累的重要方向。

煙草中綠原酸是最主要的多酚類物質，與烤煙香氣質和香氣量密切相關。目前，煙草中綠原酸合成積累研究主要側重于產物的積累及其影響因素研究，但對綠原酸合成代謝與積累機制缺乏深入的理解，不利于煙草香氣質量的定向改善，已成為制約我國烤煙定向提升香氣質量的重要“瓶頸”。因此，以煙草、番茄和馬鈴薯等近緣物種的基因組序列信息為基礎深入研究綠原酸合成代謝調控機制，同時利用轉錄組學與代謝組學等多組學聯合的方法揭示綠原酸代謝流的分配規律以及與其他代謝途徑之間的互作機制，具有重要意義。此外，將綠原酸生物合成途徑中的關鍵酶基因在微生物中進行異源表達，不僅可用于鑒定綠原酸生物合成關鍵酶基因的功能，而且可用于生產具有藥用價值的綠原酸及其衍生物，對提高煙草醫藥價值和煙草行業轉型升級都具有重要意義。

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