地下芽孢桿菌ZDC—01抑菌效果及其防效研究

邱森森 胡修俊 朱鳳蒙 張德超

摘要 對從東海海底土壤沉積物中分離獲得的菌株ZDC-01的抑菌活性、抑菌機理、室內防治效果進行了研究。結果表明，該菌株對8種病原菌具有顯著的抑菌作用，菌懸液較無菌濾液的抑制率更高，抑制率高達96.87%。通過噴霧處理刺傷接種發現，噴施ZDC-01發酵液、菌懸液的防治效果隨時間的延長稍有降低，但仍與腐霉利處理相當，而無菌濾液的防治效果較差，7 d后僅為9.53%。

關鍵詞 菌株ZDC-01；抑菌活性；抑菌機理；防治效果

中圖分類號 S476+.19 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）13-0097-02

Research on Antibacterial Effect and Control Efficiency of Bacillus subterraneus ZDC-01

QIU Sen-sen 1 HU Xiu-jun 1 ZHU Feng-meng 1 ZHANG De-chao 2

（1 Qingdao Zhongda Agritech Co.，Ltd.，Qingdao Shandong 266109； 2 Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences）

Abstract The antimicrobial activity，antimicrobial mechanism and control effect of strain ZDC-01 isolated from the soil sediments of the seabed in the east China sea were studied.The results showed that the strain had significant inhibitory effect on 8 fungi，the inhibition rate of bacterial suspension was better than that of sterile filtrate，and the inhibition rate was 96.87%.By inoculation of spray-treated stab wound it was found that the control effects of fermentation broth and bacteria suspension decreased slightly with the prolongation of time，but were still equal to that of procymidone.The control effect of sterile filtrate was only 9.53% after 7 days.

Key words strain ZDC-01；antimicrobial activity；antimicrobial mechanism；control effect

植物病害是影響植物健康、作物產量甚至生態系統穩定性的一個重要因素，更是作物生產中不可忽視的一大難題。據統計，每年因植物病害造成的減產損失為總產量的10%～15%，其中70%～80%是由病原真菌侵染所致[1-2]。植物真菌病害不僅直接造成農作物產量下降、品質降低，而且部分病原真菌還分泌多種毒素，對農產品安全造成極大的威脅。此外，目前植物真菌病害的防治以化學防治為主，但化學藥劑易造成農藥殘留、環境污染、抗藥性等一系列問題，甚至會危害人畜健康。生物防治具有安全環保、持效期長等特點，其發展趨勢與食品安全、生態環境和生物多樣性有良好的相融性[3]。因此，尋找廣譜、高效的生物農藥成為農藥發展的新方向。

隨著生物防治研究的不斷深入，從陸生資源中分離篩選出新的有效生防菌越來越難，探索新的生防資源迫在眉睫。海洋微生物因其遺傳和代謝的特殊性而具有產生新型生物活性物質的巨大潛力[4-7]，目前已有關于海洋生防微生物的報道。邵彥坡等[8]發現了1株海洋放線菌B5對13種植物真菌病害有顯著的抑制作用，并對其發酵液進行了穩定性測定；田 黎等[9]報道1株海洋芽孢桿菌B-9987的代謝產物不僅可以破壞真菌病害的菌絲，還可促進植物生長；陳 香等[10]鑒定了1株海洋短小枯草芽孢桿菌，并對其生長條件和抑菌活性進行了研究。本研究從東海海底土壤沉積物（北緯31°00′，東經124°3′）中分離篩選出1株具有抑菌活性的海洋細菌，在鑒定的基礎上對該菌株的抑菌活性、抑菌機理以及室內防治效果進行了初步研究，以期為進一步研究該菌及其對植物病害的防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株。菌株ZDC-01，由中國科學院海洋研究所從東海海底土壤沉積物中分離獲得，經形態學、生理生化特性及16S rDNA序列分析，將其鑒定為地下芽孢桿菌Bacillus subterraneus。供試病原真菌有蘋果葉枯炭疽病菌（Glomerella cingulate）、茄子灰霉病菌（Botrytis cinerea）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、柑橘炭疽病菌[Coll-etotrichum gloeosporioides（Penz.）Sacc]、蘋果炭疽病菌（Glom-erella cingulata）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea），由青島中達生物技術研究所生物實驗室提供。

1.1.2 供試培養基。2216E培養基（酵母提取物1 g，蛋白胨5 g，瓊脂粉20 g，過濾后的海水1 000 mL，pH調至7.4～7.5），用于海洋細菌菌株的活化與保存；LB培養基（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH調至7.0～7.2），用于菌株ZDC-01的發酵培養和抑菌機理研究；PDA培養基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH調至7.0～7.2），用于植物病原真菌的活化與保存。

1.1.3 供試藥劑。50%腐霉利可濕性粉劑，由日本住友化學株式會社生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株ZDC-01抑菌活性測定。采用平板對峙培養法[11]，在直徑90 mm的LB平板一側接種病原菌菌餅，在平板另一側劃線接種菌株ZDC-01，兩者相距25 mm，以單獨接種病原菌的平板作對照。于25 ℃恒溫暗培養，4 d后測量抑菌帶寬度，每處理設3次重復。

1.2.2 菌株ZDC-01抑菌機理。用接種環挑取菌株ZDC-01的單菌落接種于LB液體培養基中，于30 ℃、150 r/min條件下振蕩培養48 h，得到菌株ZDC-01種子液。按2%的初始接種量接種于98 mL新鮮LB液體培養基中，按上述條件繼續培養 48 h，即為ZDC-01發酵液。將發酵液于7 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，經細菌過濾器（孔徑0.22 μm）過濾即得無菌濾液。將發酵液在7 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，收集菌體，用無菌水洗滌菌體，并用其制成菌懸液。

采用菌絲生長速率法[12]，將無菌濾液和菌懸液分別與融化冷卻的LB培養基（45～50 ℃）混勻（稀釋50倍），倒平板，于平板中央接種直徑為5 mm的病原菌菌餅，以單獨接種病原菌的平板作對照。于25 ℃恒溫暗培養，待對照長滿3/4培養皿時，用十字交叉法測量對照組及處理組的菌落直徑，計算抑制率，每處理設3次重復。計算公式如下：

抑制率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-菌餅直徑）×100

1.2.3 菌株ZDC-01對茄子灰霉病的防治效果。采用噴霧處理刺傷接種法[13]，選擇長度240～300 mm的健康茄子，經流水洗凈后用75%酒精表面消毒，晾干備用。在果實1/3、2/3處刺傷（傷口直徑約0.3 mm，深約1.0 mm），每個果實4處傷口。將上述處理液均勻噴霧到果實上直到有水滴滴下，在無菌操作臺上吹干后再次噴霧，直至每個果實接種15 mL處理液，于24 h后在刺傷處接種茄子灰霉病菌菌餅；對照組和農藥處理組果實分別于噴霧15 mL無菌LB液體培養基和50%腐霉利可濕性粉劑2 500倍液后24 h在刺傷處接種茄子灰霉病菌菌餅。接種后果實置于25 ℃、100%相對濕度下培養，定期觀察病斑擴展情況，測定病斑面積并計算防治效果。每個處理接種3個果實，設置3次重復。計算公式如下：

防治效果（%）=（對照組病斑面積-處理組病斑面積）/對照組病斑面積×100

2 結果與分析

2.1 菌株ZDC-01抑菌活性測定

通過對峙培養，對菌株ZDC-01的抑菌活性進行了測定，結果見表1。可以看出，菌株ZDC-01對蘋果葉枯炭疽病菌、茄子灰霉病菌、白菜黑斑病菌、棉花枯萎病菌、小麥赤霉病菌、柑橘炭疽病菌、蘋果炭疽病菌、蘋果輪紋病菌8株病原菌均有不同程度的抑制作用，抑菌帶寬度在17.8～23.2 mm之間。其中，對茄子灰霉病菌的抑菌活性最高，其抑菌帶寬度為23.2 mm；其次是蘋果葉枯炭疽病菌和棉花枯萎病菌，抑菌帶寬度分別為22.7、21.8 mm；對柑橘炭疽病菌的抑菌作用最差，抑菌帶寬度為17.8 mm。

2.2 菌株ZDC-01的抑菌機理

由表2可知，菌株ZDC-01無菌濾液、菌懸液對8種病原菌的抑制率存在顯著差異。菌懸液對8種病原菌的抑制率在88.35%～96.87%之間，而無菌濾液對病原菌的抑制率在0.35%～13.73%之間，無菌濾液處理的抑制率均顯著低于菌懸液處理的抑制率。菌懸液對茄子灰霉病菌的抑制率最高，達96.87%；其后是蘋果葉枯炭疽病菌和小麥赤霉病菌，抑制率分別為94.89%、94.53%；對柑橘炭疽病菌的抑制率最低，為88.35%。

2.3 菌株ZDC-01對茄子灰霉病的防治效果

由圖1可知，菌株ZDC-01發酵液、無菌濾液和菌懸液對茄子灰霉病均有一定的防治效果，菌株ZDC-01發酵液和菌懸液處理的防治效果與腐霉利處理的防治效果不存在顯著差異（P<0.05）；但無菌濾液的處理防效較差，7 d后防效僅為9.53%。噴施菌株ZDC-01發酵液和菌懸液后，防治效果隨時間的延長有所降低，從接種3 d后的92.57%、93.12%下降至7 d后的90.37%、89.76%，但仍與腐霉利處理效果相當。

3 討論

本研究表明，地下芽孢桿菌Bacillus subterraneus抗菌譜廣、拮抗活性高；在抑菌機理的試驗中發現，菌懸液主要起抑菌作用，抑菌率高達96.87%；室內試驗中，噴施發酵液、菌懸液的防效與腐霉利處理無顯著差異，而無菌濾液的防效較差，推測在抑菌過程中菌株活體起主導作用，而代謝產物的作用甚微。由于室內與田間環境差異很大，對其能否應用于生產實踐還需做進一步的田間試驗驗證。另外，其發酵條件、運輸及儲存方式等也需要深入研究。

目前，報道的芽孢桿菌主要是從陸地土壤中篩選得到，很少來自海洋[14-17]。由于海洋環境的極特殊性，如高壓、高鹽、低營養、低溫、無光照等特點都決定了生活于其中的微生物具有不同于陸地微生物的特點，使其代謝方式具有特異性，而產生結構和功能獨特的天然活性代謝產物，具有重要的開發價值。因此，利用海洋微生物尋找新的藥物資源成為研究熱點[18]。

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