致瀉性大腸埃希菌檢測方式及結果分析

張雪

摘要： 目的；研究檢測腸道感染中致瀉性大腸埃希菌（DEC）的感染情況，了解本地區各種DEC的流行病學特征。方法；對835例腹瀉患者糞標本中分離出的大腸埃希菌，用熒光PCR法檢測致病基因，鑒定DEC。結果；共檢測出148株DEC菌株（陽性率17.1%），其中，腸聚集性大腸埃希菌（EAEC）14株，腸致病性大腸埃希菌（EPEC）22株，彌散聚集性大腸埃希菌（DAEC）28株和腸產毒性大腸埃希菌（ETEC）65株，僅eastA陽性未能分組的19株。6～10月共檢出DEC90株。0～13歲患者檢出DEC菌株11株，陽性率10.8%（11/102）；>13～60歲患者檢出DEC菌株108株，陽性率20.3%（108/532）；>60歲患者檢出DEC菌株29株，陽性率14.4%（29/201）。結論；DEC是引起腸道腹瀉的主要致病菌之一，DEC的檢出與季節和年齡有關。分子生物學的檢測方法更靈敏，臨床實驗室應選擇更加靈敏的方法，加強對致瀉性大腸埃希菌的檢測。

關鍵詞： 大腸埃希菌，致瀉性；致病基因；腸道感染；

大腸埃希菌是人腸道中的正常菌群，其中有些菌株攜帶致病基因，能引起腹瀉，稱為致瀉性大腸埃希菌（DEC）。根據DEC的致病特點和攜帶的致病基因大致分為：腸致病性大腸埃希菌（EPEC）、腸出血性大腸埃希菌（EHEC）、腸產毒性大腸埃希菌（ETEC）、腸聚集性大腸埃希菌（EAEC）和彌散聚集性大腸埃希菌（DAEC）等。DEC是引起腹瀉的常見致病菌，其致病機制與致病基因或獲得性毒力質粒有關，常規的細菌培養與鑒定方法不能鑒別各種致病性大腸埃希菌，檢出率較低。本研究用分子生物學方法檢測大腸埃希菌的10種致病基因，以了解本地區腸道感染中DEC的感染及流行情況。其中，eae、bfpa為EPEC 的致病基因，LT、ST為ETEC 的致病基因，ial 為EHEC 的致病基因，Aggr 為EAEC 的致病基因，draac 為DAEC 的致病基因，eastA為EAEC 的耐熱腸毒素致病基因，VT1、VT2 為兩種不同的VERO 毒素基因片段。

一、材料與方法

1.標本來源，2015年1月至2015年12月收集本院急診及腸道門診腹瀉患者糞便標本835例。

2.試劑與儀器，HE平板和營養瓊脂等培養基由某公司提供，PCR引物、探針及Taq酶和dNTP等試劑均由某賽百盛生物技術有限公司合成與提供，熒光定量PCR儀為Bio-RadIQ5。大腸埃希菌ETEC診斷血清為丹麥哥本哈根產品。

3.細菌培養鑒定標本接種于HE平板，35℃培養18～20h，挑取單個發酵乳糖菌落轉種營養瓊脂，按照《全國臨床檢驗操作規程》要求鑒定大腸埃希菌，對部分不典型菌株用API20E確認。

4.細菌核酸制備挑取數個分純的菌落，放入含有0.1%tritonX-100及0.5mmol/LEDTA配制溶液100μL懸浮，100℃金屬浴5min，12000×g離心5min，取上清用于PCR檢測。

5.PCR反應用Premier公司Beacondesigner7.9軟件獲取基因編號序列，用軟件選取致瀉性大腸埃希菌各致病基因上下游引物和探針。PCR反應體系：Mg2+濃度為5mmol/L，上下游引物濃度為0.25μmol/L，探針濃度為0.15μmol/L，dNTPs各0.2mmol/L，Taq酶為2IU，模板為3μL，用dH2O

補足總體積為30μL。PCR反應條件：37℃2min，94℃3min，1循環；94℃10s，60℃40s，40循環；60℃測定熒光值。

二、結果

1.DEC檢測結果，835例腹瀉患者糞便標本，經培養共檢測出DEC148株，陽性率為17.7%（148/835）。其中，EAEC（Aggr陽性）14株，EPEC[eae陽性和（或）bfpa陽性]22株，DAEC（draac陽性）28株和ETEC[ST陽性和（或）LT陽性]65株，僅出現eastA陽性不能分類19株，未檢出EHEC。

2.不同季節陽性菌株種類分布，6～10月DEC菌株最多，為90株，與此段時間腹瀉高發相關。不同陽性菌株的檢出情況也呈現季節性，EAEC在1～3月未檢出，其余時間呈現散發分布；DAEC在1～3月和10～12月檢出較多，5～9月未檢出；EPEC和ETEC在9～9月檢出最多。見表1。

-：未檢出。

3.陽性菌株分離患者年齡分布，0～13歲患者檢出DEC菌株11株（EAEC2株、DAEC4株、EPEC3株、ETEC1株和僅eastA陽性1株），陽性率10.8%（11/102）；>13～60歲患者檢出DEC菌株108株（EAEC9株、DAEC21株、EPEC16株、ETEC49株和僅eastA陽性13株），陽性率20.3%（108/532）；>60歲患者檢出DEC菌株29株（EAEC3株、DAEC3株、EPEC3株、ETEC15株和僅eastA陽性5株），陽性率14.4%（29/201）。

4.方法學驗證結果。分別用陽性對照菌株和陰性對照菌株進行試驗，陽性菌株均能得到設計預期的特異性擴增曲線，陰性對照菌株均沒有得到特異性擴增曲線。

三、討論

DEC是引起腹瀉的常見病原菌之一，由于形態與普通大腸埃希菌相似，傳統的培養和血清凝集法檢測陽性率偏低，且同一血清型下因攜帶不同的致病基因又可分為不同的致病類型，給臨床診斷帶來了困難。近年，國內外已有學者依據不同菌株致病基因差異用分子生物學的方法來進行鑒定，分子生物學可檢測致病基因，更能反映菌株的致病情況，并且，靈敏度也高于血清學檢測，因此分子生物學的方法可能會成為鑒定致DEC的常規方法。參考國外學者的分子生物學方法，通過設計各致病基因的PCR引物進行目的基因特異性擴增，共檢出帶有致病基因的DEC148株（陽性率17.7%），其中，EAEC（Aggr陽性）14株，EPEC[eae陽性和（或）bfpa陽性]22株，DAEC（draac陽性）28株和ETEC[ST陽性和（或）LT陽性]65株，僅出現eas-tA陽性不能分類19株，未檢出EHEC。研究發現，DEC菌株檢出率與季節有關，6～10月DEC菌株最多（90株），與此段時間腹瀉高發相關。不同陽性菌株的檢出情況也呈現季節性變化，EAEC在1～3月未檢出，其余時間呈現散發分布；DAEC在1～3月和10～12月檢出較多，5～9月未檢出；EPEC和ETEC在7～9月檢出最多。本研究發現，DEC菌株檢出率與與年齡也有一定相關性，0～13歲患者檢出DEC菌株11株（EAEC2株、DAEC4株、EPEC3株、ETEC1株和僅eastA陽性1株），陽性率10.8%（11/102）；>13～60歲患者檢出DEC菌株108株（EAEC9株、DAEC21株、EPEC16株、ETEC49株和僅eastA陽性13株），陽性率20.3%（108/532）；>60歲患者檢出DEC菌株29株（EAEC3株、DAEC3株、EPEC3株、ETEC15株和僅eas-tA陽性5株），陽性率14.4%（29/201）。有研究發現DEC菌株的檢出情況各個地區也有不同。分析本地區DEC菌株季節性特點和與年齡的相關性，為本地區以后的預防控制和針對性的治療提供了可靠的依據。

總之，DEC作為引起腸道感染的主要病原菌，現有的檢測方法已不能滿足臨床的需要，相關部門應加強協作，使用準確、可靠的方法檢測病原菌，為疾病的流行、控制、預防和治療提供幫助。

參考文獻

[1]趙文梅，探討致瀉性大腸埃希菌檢測方式及結果分析.2017.

[2]陳松，分子生物學技術在腸致瀉性大腸桿菌診斷中的應用.2017.