CRISPR/Cas基因編輯技術及應用

李迪

摘要：CRISPR/Cas系統是古菌、細菌等在長期進化過程中形成的獲得性免疫系統。以Cas9蛋白為核心的Ⅱ型系統經改造后成本低、歷時短、操作簡單，在植物、動物領域都取得了許多成果。本綜述介紹了CRISPR/Cas的產生、作用機制、應用前景等，為CRISPR/Cas系統相關研究提供參考。

關鍵詞：CRISPR/Cas；基因定點編輯；分子機制；應用前景

一、發現

CRISPR/Cas系統是廣泛存在于古菌、細菌等的一種獲得性免疫系統，是這些生物防御病毒、質粒等入侵自身基因組的外源遺傳物質的“武器”。1987年日本研究人員首次在大腸桿菌中發現了一些間隔的短回文序列，但尚不了解其意義。2002年Jansen等將這種序列正式命名為CRISPR（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats），即成簇的規律間隔的短回文重復序列。2005年多項研究顯示CRISPR的間隔區與噬菌體或質粒序列有高度同源性。2007年Barrangou等發現通過增加和敲除嗜熱鏈球菌中的CRISPR序列可改變該菌對噬菌體的免疫力。科研人員還發現在CRISPR序列周圍存在可編碼核酸酶、解旋酶等的Cas基因。2012年Jennifer等發現了一個簡單的CRISPR/Cas系統，它通過Cas9核酸內切酶以及以CRISPR序列為模板轉錄出來的兩種RNA就可以剪切dsDNA。2013年FengZhang等首次證實CRISPR/Cas9可對人類內源基因進行定向切割。隨著研究人員的不懈努力以及科學技術的快速發展，目前CRISPR/Cas技術在植物、動物等領域已經帶來了許多優秀成果。

二、結構與分類

完整CRISPR位點依次包括Cas基因，前導區，由短回文重復序列（repeat）和間隔區（spacer）構成的CRISPR序列。上游Cas基因有豐富的多態性，編碼蛋白有核酸酶的功能。前導區可看作CRISPR序列的啟動子，激活轉錄。下游CRISPR序列中的回文序列長度一般在21～48bp，可形成發卡結構。[1]間隔區即細菌捕獲的外源DNA，相當于細菌建立的“黑名單”，當入侵者再次來襲細菌可立即識別并應答，即所謂的獲得性免疫系統。隨著多種細菌基因組測序的相繼完成，越來越多的CRISPR/Cas系統被發現。目前依據Cas基因可把已發現的CRISPR/Cas系統分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。研究最為透徹的是Ⅱ型，它包括2個亞型，標記基因為Cas9，編碼蛋白含有RuvC、HNH核酸酶結構域。

三、Ⅱ型CRISPR/Cas系統的分子作用機制

不同的CRISPR/Cas系統在執行其功能時所涉及的Cas蛋白的種類及數目不同。Ⅰ型和Ⅲ型系統都需要多種Cas蛋白形成的復合體參與，Ⅱ型系統只需Cas9就能完成對dsDNA的切割。本綜述主要介紹Ⅱ型系統的分子作用機制。

（一）外源DNA捕獲

外源DNA首次攻擊細菌時，Cas基因合成Cas1和Cas2形成蛋白復合體，從外源DNA中切割一段序列（即原間隔序列protospacer）作為二次免疫的“憑證”，插入到宿主原CRISPR序列中成為間隔序列之一。protospacer兩端的幾個堿基非常保守，通常為NGG，稱為原間隔序列鄰近基序（PAM）。外源DNA入侵時，Cas1和Cas2蛋白復合體對其掃描，識別PAM序列后完成切割，整合到宿主CRISPR序列5端，形成新的CRISPR序列。

（二）crRNA的合成

當同種入侵者再次攻擊宿主細菌時，前導區激活CRISPR序列的轉錄，其中repeat合成tracrRNA，整個CRISPR序列合成PrecrRNA，二者組成具有二級結構的復合體，招募Cas9蛋白。RNaseⅢ協助選定并切割對應spacer，形成最終crRNA、tracrRNA、Cas9復合體。

（三）靶向干擾

復合體一旦識別到與crRNA互補的protospacer，將結合到對應的PAM附近。使目標外源dsDNA解旋后，crRNA與帶protospacer的互補鏈結合，Cas9的HNH結構域對互補鏈進行切割，RucV結構域則對非互補鏈進行切割，產生DNA雙鏈斷裂（DSB），外源DNA被沉默，宿主完成二次免疫。

四、CRISPR/Cas基因編輯技術的發展

CRISPR/Cas系統使外源dsDNA產生DSB后將引起HR或NHEJ，實現靶基因的敲入與敲除。傳統基因編輯技術包括鋅指核酸酶（ZFNs）和轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs）。ZFNs和TALENs均由DNA結合結構域、核酸酶結構域融合而成，但這兩項技術花費高、操作難度大、歷時長、易脫靶。CRISPR/Cas系統能對多靶位點同時進行編輯，在Cas9確定的條件下只需要設計特異的guideRNA即可切割，成本低，因此逐漸興起。

CRISPR/Cas基因編輯技術以crRNA與tracrRNA形成的嵌合分子為原型，設計針對靶位點的sgRNA，介導切割，產生DSBs。Hwang等[2]利用CRISPR/Cas9在斑馬魚胚胎中實現drd3、gsk3b的定點突變，這是TALENs尚不能完成的。WANG等[3]將sgRNA與Cas9mRNA導入小鼠受精卵中，首次在動物體內實現同時敲除2個內源基因即Tet1和Tet2。Niu等[4]以食蟹猴受精卵為材料同樣利用此法成功干擾PPARγ和RAG1，首次在靈長類實現CRISPR/Cas9基因修飾。Zhang等給Cas9蛋白加上激活類結構域，成功激活10個人源基因，建立人類sgRNA文庫進一步豐富基因組注釋。Gao等[5]利用CRISPR/Cas系統完成了4個水稻基因、1個小麥基因的定點編輯，并在T0代獲得了水稻PDS基因缺失的純合突變體。此外該研究組通過在DSB引入HR修復途徑實現12bp序列的knockin，使CRISPR/Cas系統在重要經濟農作物的育種方面前景更加開闊。Zhu等[6]利用CRISPR/Cas系統對擬南芥11個靶位點成功誘導突變，突變后代經分析符合孟德爾定律。

CRISPR/Cas系統在基因組編輯中最明顯的問題就是脫靶現象。gRNA可能會與PAM序列鄰近8～12bp區域錯配從而對非靶位點進行編輯。因此目前提高精確度是更大程度上發揮CRISPR/Cas系統作用的切入點。CRISPR/Cas系統為基因組定點編輯技術增添了濃墨重彩的一筆，其成本低，歷時短，操作簡單，多數相關實驗室都能進行課題研究。在植物領域內通過對水稻、小麥等重要農作物進行高效的分子育種，使產量、抗性品質達到較理想的狀態。在動物領域內通過構建小鼠、靈長類等的突變體，對遺傳疾病、腫瘤分子機制的研究與靶向治療，為人類帶來更多福音。

參考文獻：

[1]王瑋瑋，等.CRISPR/Cas9基因編輯系統研究進展及其在動物基因編輯研究中的應用[J].畜牧獸醫學報，2016，47（07）：12991305.

[2]HwangWY，etal.EfficientgenomeeditinginzebrafishusingaCRISPRCassystem.NatBiotechnol，2013，31（3）：227229.

[3]WANGH，etal.OnestepgenerationofmicecarryingmutationsinmultiplegenesbyCRISPR/Casmediatedgenomeengineering[J].Cell，2013，153：910918.

[4]NIUY，etal.GenerationofgenemodifiedcynomolgusmonkeyviaCas9/RNAmediatedgenetargetinginonecellembryos[J].Cell，2014，156：836843.

[5]GaoCX，etal.TargetedgenomemodificationofcropplantsusingaCRISPRCassystem.NatBiotechnol，2013，31（8）：686688.

[6]ZhuJK，etal.EfficientgenomeeditinginplantsusingaCRISPR/Cassystem.CellRes，2013，23（10）：12291232.