醬油的風味物質及其研究進展

童星，彭勃

(1.佛山市海天(高明)調味食品有限公司，廣東 佛山 528511；2.佛山市海天調味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000)

醬油是以大豆、面粉等糧食作物為主要原料，經微生物發酵釀造而成具有獨特色、香、味的傳統調味品。目前，我國醬油每年生產量超過600萬噸，約占世界總產量的60%[1]。醬油中已發現的風味物質超過300種，主要為多肽、氨基酸、低聚糖、脂肪酸、甘油以及各種有機酸與醇類經酯化生成的酯類等。韋氏辭典中對風味的定義為“所嘗到的、嗅知的和觸知的口中食物的總體感受”。醬油風味即為醬油的香味、滋味等，風味的形成需要在具體釀造過程中使曲霉、耐鹽酵母和細菌在發酵過程中協同作用[2]。醬油的風味物質復雜而平衡，獨具特色，對醬油風味物質的研究是當前調味品行業中的熱點。

1 醬油風味的物質基礎

醬油中的風味物質來源十分復雜，是原料中的營養成分經過一系列發酵或酶解的作用而產生的各級分解物，以及這些產物之間發生進一步的生物化學反應從而得到的產物，其涉及的過程主要包括以下幾種。

1.1 通過蛋白質降解作用產生的風味物質

醬油在釀造過程中，需要用到大豆或豆粕以及小麥等糧食作物作為原料，這些原料中含有豐富的蛋白質，經過高溫煮制后，原料中的蛋白質被破壞，二級結構發生改變，同時經過米曲霉等微生物分泌的蛋白酶的作用發生降解，降解產物包括多肽、寡肽和氨基酸，這些分解產物不僅能夠帶來鮮味，有的還能為醬油的風味提供濃厚感[3]。氨基酸類物質常常具有多種風味功能，是醬油風味中最重要的貢獻者之一，例如：Ala，Gly，Ser，Thr，Lys等氨基酸具有甜味作用；而Arg，His，Phe，Leu等氨基酸則帶有苦味。蛋白質降解產物不僅是醬油中主要的滋味物質，也對醬油的揮發性氣味有著重要的意義，因為它們常常能夠成為揮發物質的前體物質[4]。

1.2 通過淀粉的糖化作用產生的風味物質

醬油制曲過程中的重要微生物米曲霉能夠在制曲階段分泌多種酶類，其中包括液化酶(α-淀粉酶)與糖化酶(葡萄糖苷酶)這2種重要的淀粉酶。這2種淀粉酶分別針對淀粉鏈的α-1,4-糖苷鍵和α-1,6-糖苷鍵進行切除，在這些酶類的作用下，原料中的淀粉類物質能夠被逐步水解為小分子的葡萄糖[5]。在米曲霉生長的過程中，原料中的淀粉開始分解但并不完全，直到發酵階段，大量的淀粉酶經微生物代謝而產生，使淀粉繼續糖化，生成多種小分子碳水化合物，如葡萄糖、麥芽糖和糊精等。淀粉糖化所產生的糖類物質，使醬油具有一定的甜味，并且這些糖分成為制曲及發酵過程中微生物生長的碳源，是醬油微生物發酵的物質基礎。同時，碳水化合物是美拉德反應中的必需化合物之一，這就為醬油風味、色澤、體態的形成奠定了基礎[6]。

1.3 通過脂肪的水解作用產生的風味物質

黃豆等原料中都含有大量的油脂，這些油脂可能會在發酵過程中發生酸敗，從而導致不良氣味的產生，但同時油脂的分解也會對醬油的香氣做出貢獻。油脂在制曲過程中可以被米曲霉所分泌的脂肪酶所降解，產生脂肪酸等物質。脂肪酸本身對香氣并沒有太大作用，但經過長達半年的發酵后，能夠被氧化成一系列脂肪酸鏈等化合物，再經過進一步的化學反應，最終生成醛類、酮類、酯類等具有香氣的物質。其次，油脂降解生成的各種脂肪酸與醬醪中的酵母發酵產物乙醇作用生成各種小分酯類，酯類具有芳香香氣[7]。

1.4 通過其他菌種的代謝作用產生的風味物質

酵母菌和乳酸菌在醬油發酵中、后期代謝活躍，其中酵母菌如釀酒酵母和魯氏酵母等能夠分泌酒化酶，該類酶系的主要作用是將葡萄糖轉化為乙醇和二氧化碳。在醬醪中，部分葡萄糖在酒化酶的作用下發生轉化，同時產生一系列副產物。酒化作用后生成的乙醇，能夠繼續被氧化為酸類，部分進一步反應為酯類，此類物質是醬油香氣的重要組成部分，另一部分繼續殘留在醬油中。此外，醬油中還有一些通過氨基酸脫羥基、氨基而形成的戊醇、丁醇等醇類物質，它們也具有一定的呈味作用，并且同樣具有酯化反應的潛能。這些物質是醬油風味的有效增強劑，不僅能夠緩解咸味，還使醬油的口感變得更加柔和、濃郁。

2 醬油風味物質的研究進展

發酵醬油的風味能夠受到多種因素的影響，包括原料類型、發酵菌種、工藝條件等。隨著研究水平的不斷提高，近年來人們開始結合人體感官評價、分子層面研究以及人工智能分析，以達到對風味更加深入的探究效果。

2.1 醬油中香氣物質的分析

類似于其他食品的風味，醬油的風味也包括香氣和滋味2個重要因素。香氣主要是在其發酵中形成的，這些揮發性物質相互平衡，成為醬油中特征香氣的主要來源。

1961年，Yokotsuka等[8]首次在醬油中發現風味化合物4-乙基愈創木酚，并且將該物質作為醬油風味成分的指標。Nunamura等[9-11]于1978～1984年在深入探究醬油風味時，對其風味物質進行了簡單的分類，即分為93種酸性物質、35種堿性物質和142種中性物質。Petra等人[12]對日本市售醬油的風味物質進行了研究，利用香味提取稀釋分析(Aroma Extract Dilution Analysis，AEDA)定量分析，得到多種具有高稀釋因子的活性風味物質，其中2-苯乙醇的風味稀釋因子高達4096，3-甲硫基丙醛、4-羥基-2(5)-乙基-5(2)-甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(HDMF)等物質的風味稀釋因子為1024。同時還研究了熱處理對醬油風味物質的影響，發現熱處理后HEMF和HDMF等物質含量增加，醬油的整體香氣發生變化。

國內也有很多研究者對醬油中的風味物質及其形成機理進行了深入的研究。熊芳媛等[13]提取了老抽醬油中的風味成分，并通過氣質聯用色譜儀(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)分離鑒定其化學組成，共鑒定出55種化合物，其中3,8-二羥基-2-甲基色酮等7種物質對老抽風味成分的貢獻最大。張艷芳等[14]用固相微萃取(Solid-Phase Microextraction，SPME)結合GC-MS對低鹽固態發酵醬油和高鹽稀態發酵醬油的揮發性風味成分進行了分析，共鑒定了52種物質；具有蘑菇香氣的1-辛烯-3醇等17種成分為低鹽固態發酵醬油所特有；9種成分為高鹽固態發酵醬油所特有。

近幾年，通過人工智能結合的方式研究醬油香氣物質的研究不斷加深。日本的Kaori等[15]通過氣相色譜-嗅覺辨別法(Gas Chromatography-Olfactrometry，GC-O)對醬油的風味成分進行分析，檢測到28種活性風味物質，再利用氣體提取物稀釋分析(Aroma Extraction Dilution Analysis，AEDA)方法，發現了醬油中的幾種高風味稀釋因子物質，包括HEMF、3-甲基-1-丁醇、3-甲硫基丙醇等。Meng Qi等[16]通過GC-O測定生醬油和熱處理醬油的香氣物質，對香氣物質的分類見表1。其中乙基-2-甲基丙酸酯、丁酸乙酯、乙基-2-甲基丁酸酯、乙基-3-甲基丁酸酯和乙基-4-甲基戊酸酯比其他芳香化合物具有較高的風味稀釋因子。

表1 GC-O分析中揮發性化合物分類

總體來看，國內外對醬油香氣成分的研究較多，近300種揮發性風味化合物已經被分離、鑒定，并確定HEMF、4-乙基愈創木酚、3-甲硫基丙醇等為關鍵醬香物質。

2.2 醬油中滋味物質的分析

醬油的滋味以咸鮮味為主，并略帶有甜、酸等味道的復合體系。游離氨基酸、水溶性肽以及美拉德反應產物等是醬油的主要呈味物質。

20世紀80年代，Tomita等[17]首次發現米曲霉產生的谷氨酰胺酶能催化L-谷氨酰胺和氨基酸(或肽)間的γ-谷氨酰轉肽反應。因此，將這種谷氨酰胺酶添加到醬油發酵模型中能顯著降低醬油中谷氨酰胺和焦谷氨酸的含量，并增大谷氨酸和γ-谷氨酰肽的濃度，增強醬油的鮮味。

21世紀初，Lioe等[18]對日本市場上流行的3種醬油(Koikuchi，Tamari，Shiro)的成分進行了檢測，發現甜味氨基酸、鈉鹽和谷氨酸是這3種醬油中的主要呈味物質，而通過對醬油鮮味物質的深入研究[19-21]，發現醬油鮮味基本上來源于分子量少于500 Da的超濾部分；閾下濃度的L-α-芳香簇氨基酸(L-Phe, L-Tyr)與MSG/NaCl、MSG/IMP、MSG/GMP協同作用可提升醬油的鮮味。

近幾年，Kaneko等[22]運用多級色譜從醬油中分離鑒定出5個化合物： Fru-pGlu，Fru-Val，Fru-Met，pGlu-Gln，pGlu-Gly。味覺實驗表明它們本身無明顯鮮味，但能顯著提升0.6 mmol/L谷氨酸的鮮味，味值由1.1提升至2.5；將此5種化合物加到重建醬油中，重建醬油的鮮味值由2.8提升到3.2。Frerot等[23]運用UPLC-MS/MS從醬油中新鑒定出pGlu-Asp，pGlu-Val，Lac-Glu 3個谷氨酸衍生物。2014年，Shiga等[24]通過代謝組學發現醬油中普遍存在一種比MSG和IMP鮮味更強的化合物Fru-Glu。王丹丹等[25]采用電子舌技術和多變量統計學方法，對醬油的滋味進行了評價和分析，發現市售的生抽醬油風味差異較大，尤其是咸味和酸味，而在苦味和澀味上差異較小，同時經過一系列分析發現，草酸的含量能夠在一定程度上影響生抽醬油的風味。相對于醬油揮發性香味物質來說，分子水平的滋味研究比較滯后，特別是有關醬油的小分子呈鮮味化合物研究正處在迅猛發展階段。

2.3 醬油發酵過程中的風味物質變化

醬油的釀造過程漫長而復雜，常常達到6個月以上，通過對醬油釀造過程進行追蹤，能夠有效研究其風味變化的規律。目前這部分的研究相對較少，但也有部分研究者以醬油整個釀造過程中的風味物質變化為線索，探究其物質變化的規律。

Young等[26]用對韓國的傳統發酵醬油釀造過程中揮發性物質的變化規律進行了探究，發現了62種物質風味物質。在發酵初期，主要產生醇類、酮類、吡嗪類等物質，而酸類物質和醛類物質在初期的含量較少，隨著發酵過程的進行而不斷增加。高獻禮，等[27]以GC-MS鑒定比較了中國傳統釀造醬油在發酵5～150天的期間內醬醪中的風味物質變化，同時比較了發酵期為150天醬油在80 ℃下分別加熱30 min和60 min后風味物質的變化，隨著發酵期的延長和加熱(80 ℃/60 min)，醇類、醛類和酮類的醇味、焦糖味有明顯的減少，呋喃酮類和苯酚類以及含硫化合物則有輕微的增多。

2.4 醬油風味的改善

根據醬油風味的眾多影響因素，可以通過菌種改造、原料配比等方式對醬油的風味進行探究，通常操作簡便，可行性強，已有眾多成果應用于醬油生產中。

早在1984年，Sugiyama等[28]對醬油中的常用發酵菌種米曲霉(A.oryzae)、醬油曲霉(A.sojae)、耐鹽乳酸菌(P.halophilus)、耐鹽酵母菌(S.rouxii，C.versatilis)等對醬油風味的影響進行了探討，并確定了發酵菌株的最佳培養條件，使醬油達到最佳風味。李荔等[29]研究了在產酶能力上具有互補性能的米曲霉和醬油曲霉，結果表明：米曲霉Aspergillussojae125的谷氨酰胺酶是AS3.042的1.48倍，2個菌株最佳的復合比例為4∶1，與3.042菌株單獨制曲相比，氨基氮生成率提高5.37%，L-谷氨酸生成率提高25.41%，醬油風味質量得到明顯提升。

近年來，也有一些研究者通過在醬油中添加其他菌種來改善醬油的風味。Thin等[30]對泰國醬油進行了研究，將魯氏酵母和季也蒙畢赤酵母接種在醬油釀造初期，并且對醬醪用SPME-GC-MS等方法進行檢測，發現在接種以上2種酵母的醬醪中，醇類、酯類、呋喃酮、苯甲酸、麥芽酚等重要風味物質的含量更高。楊希飛等[31]在發酵過程中添加嗜鹽四聯球菌，發現添加106cfu/mL的嗜鹽四聯球菌能夠改善醬油風味，使揮發性物質種數和總量上比對照組有明顯增加。戚晨晨等[32]在高鹽稀態醬油發酵的不同時間添加耐鹽乳酸菌，發現對醬油中風味物質含量的影響較大，在45天添加乳酸菌的醬油樣品中，總酸和無鹽固形物的含量明顯提高，含有豐富的風味物質，而在30天添加則效果相差得多。

很多研究者對醬油的發酵原料進行了優化，除了更換現有原料之外，還可以通過適當的特殊處理改變原料自身的性質，最終對醬油的風味造成影響。Zhang等[33]對原料中的豆粕進行膨化處理，使用HS-SPME和GC-MS等技術，對醬油中揮發物化合物進行鑒別，結果在膨化豆粕原料醬油(EMSF)中檢測出40種揮發性化合物，而普通混合原料醬油(CMSF)中只檢測出了24種，且膨化豆粕原料發酵的醬油中各氨基酸含量普遍增加，具體見表2。經研究，大豆經膨化處理后能夠具有海綿狀組織，增加發酵菌種與原料的接觸面積，有利于菌子的生長附著，有效提高原料的利用率，使成曲獲得更高的酶活力。

表2 氨基酸含量分析

另外，也有些研究者直接在醬油發酵原料中添加酶類等添加物，以提高醬油的風味水平。例如，Kijima等[34]從枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中提取出具有谷氨酰胺酶活性并且耐鹽的谷氨酰胺轉肽酶，并將其加入到醬醪的發酵中，明顯提高了醬油的鮮味。楊明泉等在醬醪發酵過程中添加0.05%的酵母抽提物可顯著提高醬油原油的氨基酸態氮含量，醬油中鮮味氨基酸和苦味氨基酸的相對含量增加，甜味氨基酸的相對含量降低，醬油原油的鮮味和甜味增加。劉通訊等[35]在醬油中復合添加酵母抽提物和大豆呈味肽，結果顯示酵母抽提物和大豆呈味肽按3∶2的配比添加至醬油中，醬油風味最佳，其鮮味和協調性得到了明顯改善。

3 展望

總體來說，近年來人們對于醬油中風味物質已經有了較多的研究，已開發出多種菌種、原料等優化醬油風味的工藝條件，并且對揮發性香氣物質以及呈鮮味物質的變化規律具有一定的認識，尤其是近10年來人工智能技術的加入，與GC-MS、HS-SPME等大型精密儀器聯合使用，能夠十分準確地定位各呈味物質的作用與分子結構，這也體現了未來食品中風味物質研究的發展趨勢。然而，在醬油滋味的研究中，電子舌等人工智能感官系統的結合應用仍然較少，這與這項技術的眾多不可控性有關，若能將味覺、嗅覺等多項人工智能技術與微生物學、有機化學、發酵工程等多學科聯合運用，不僅能夠更加系統地了解醬油等傳統發酵調味品的風味規律，減少發酵生產中的不可控因素，也能夠廣泛應用于食品行業中，為其他方面的研究提供重要基礎。