人胎盤絨毛膜間充質干細胞分離培養的新方法*

唐書生，孫遜沙，吳潔瑩，陸琰，陳勁松，李發濤，唐婕，吳韶清Δ

(1.廣州醫科大學附屬廣州市婦女兒童醫療中心，廣州 510623；2.中山大學附屬廣州市婦女兒童醫療中心，廣州 510623；3. 中山大學附屬第一醫院，廣州 510080)

1 引 言

間充質干細胞是一種來源于中胚層，具有多向分化潛能的成纖維樣貼壁細胞，是組織工程研究中一種重要的種子細胞和基因治療的載體，已成為干細胞臨床轉化應用研究的熱點[1-3]。目前已經從骨髓、脂肪、牙髓、羊膜、絨毛膜、蛻膜、臍帶、臍血、睪丸、扁桃體等組織中分離培養出間充質干細胞[4-6]，但是如何體外簡便、快捷分離培養原代間充質干細胞是獲得間充質干細胞研究材料的關鍵。本研究旨在建立一種分離培養hpcMSCs的新方法，力求簡化操作、提高效率，為進一步探討間充質干細胞的應用提供基礎。

2 材料與方法

2.1 材料

經醫院倫理委員會批準，征得產婦和家屬書面知情同意的情況下，在廣州市婦女兒童醫療中心產科獲取剖宮產健康足月的新生兒胎盤，胎盤無老化鈣化，孕婦的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV、梅毒等傳染性感染性疾病檢測為陰性。

2.2 試劑和設備

StemPro MSC SFM CTSTM培養基(美國Gibco公司)，胰蛋白酶(美國Gibco公司)，膠原酶Ⅱ(美國Gibco公司)，無RNA酶的DNA酶(美國Promega)，細胞茜素紅染色試劑盒(中國紐杰美公司)，油紅O染色試劑盒(中國南京建成)，成骨、成脂誘導分化試劑盒(美國Gibco公司)，CCK-8檢測試劑盒(日本同仁公司)，流式細胞儀及標記抗體(美國BD公司)，CO2培養箱(德國Lab公司)，手持電動勻漿器(美國PRO Scientific公司)，倒置顯微鏡(日本NIKON公司)。

2.3 實驗方法

2.3.1hpcMSCs的分離培養 將產房獲得的胎盤置于無菌盒中，加入500 ml生理鹽水，并轉運至GMP實驗室。無菌狀況下，撕去胎盤的羊膜，用剪刀剪取胎盤絨毛膜，并剪成1cm左右條塊狀，用鑷子擠壓，同時用生理鹽水反復沖洗至澄清，用鑷子擠壓干凈血液和水份后，用電子天平稱量，獲得絨毛膜濕重。然后加入適量生理鹽水，用手持電動勻漿器處理至細小顆粒狀(約米粒大小)，再次用生理鹽水反復沖洗至澄清，接著繼續用勻漿器處理至肉糜狀(稍有顆粒感，能夠用吸管自由吸取)；離心500 r/min，5 min，去除上清液，沉淀中加入同體積的胰蛋白酶和膠原酶Ⅱ，于37℃，消化0.5～3 h。用生理鹽水洗滌兩次后，加入培養基，按照每10 g絨毛膜組織接種一T75培養瓶的份量進行接種。然后置于飽和濕度、37℃、體積分數為5%CO2的培養箱中靜止培養7 d后，置倒置顯微鏡下觀察并記錄細胞狀態。倒出培養液，并用少量生理鹽水沖洗培養瓶底，重新加入新鮮培養基。待培養瓶中，細胞生長到80%～90%融合狀態時，用胰蛋白酶消化后按1∶2傳代。

2.3.2hpcMSCs的形態學觀察 除接種后靜止培養7 d，每日在倒置顯微鏡下觀察hpcMSCs的形態并拍照。

2.3.3流式細胞術檢測hpcMSCs的表面標記 取P3代細胞，分別加入流式抗體CD45、CD34、CD90、CD105、CD73、CD14、CD19、HLA-DR和同型對照抗體10 ul，混勻后避光室溫孵育30 min，用PBS洗滌2次(1500 r/min，5 min)，重懸后進行流式細胞術檢測和分析。

2.3.4測定細胞生長曲線 取P3代細胞，用培養基吹打成單細胞懸液，以2×104/cm2接種于96孔板上，設置7組，每組7孔，置于飽和濕度、37℃、體積分數為5%CO2的培養箱中培養，每隔24 h，任意選擇一組，加入10 ul CCK-8溶液，酶標儀檢測各組細胞吸光度值(激發波長450 nm)，用無細胞的培養基做空白對照，連續7 d，每天取7孔的吸光度均值繪制生長曲線。

2.3.5hpcMSCs成骨、成脂誘導分化潛能鑒定 取P3代細胞，接種于24孔培養板，當細胞生長到80%融合度時，換成成骨或成脂誘導培養基，再分別誘導培養四周后，用茜素紅染色試劑盒檢測成骨誘導分化，用油紅O染色試劑盒檢測成脂誘導分化，分別用未加誘導分化培養基進行對照。倒置顯微鏡下觀察分析和拍照。

3 結果

3.1 hpcMSCs分離、接種和培養

從接收標本到完成接種培養，一個胎盤絨毛膜能夠在一個工作日內處理完成，胎盤絨毛膜經處理后，離心后的沉淀中，沒有明顯的紅細胞。按照每10 g絨毛膜組織接種一T75培養瓶的份量進行接種，接種后，靜止培養7 d后全量換液。

3.2 hpcMSCs的形態

初次換液時，可見細胞呈散在分布的貼壁生長，部分細胞為單個或幾個細胞一起貼壁生長，有的細胞剛從組織塊中爬伸出來。細胞為長梭形，有胞漿突起，少數為多角形。傳至P3代，細胞形態較均一，成平行排列或漩渦狀的成纖維細胞樣形態(見圖1)。

3.3 hpcMSCs免疫表型

流式細胞術檢測P3代人胎盤源絨毛膜間充質干細胞(見圖2)，均高表達CD90、CD105、CD73，陰性表達CD34、CD45、CD14、CD19、HLA-DR。

圖1hpcMSCs的形態(×50)

Fig1MorphologyofhpcMSCs(×50)

圖2hpcMSCs的免疫表型

Fig2ImmunophenotypeofhpcMSCs

3.4 hpcMSCs生長曲線

CCK-8法繪制P4代人胎盤源絨毛膜間充質干細胞的生長曲線，1～2 d間充質干細胞處于潛伏期，增殖不明顯；3～5 d細胞進入對數生長期，細胞增殖加速；6～7 d細胞進入平臺期，生長緩慢(見圖3)。

3.5 hpcMSCs誘導分化潛能鑒定

P4代人胎盤源絨毛膜間充質干細胞經成脂、成骨分化培養基誘導4周后，分別用茜素紅或油紅O染色(見圖4)。

圖3hpcMSCs生長曲線

Fig3GrowthcurveofhpcMSCs

圖4hpcMSCs誘導分化檢測(×200)

(A).表示成脂誘導分化；(B).表示成骨誘導分化

Fig4InducingdifferentiationofhpcMSCs(×200)

(A).AdipogenicdifferentiationofhpcMSCswasobservedundermicroscope; (B).OsteogenicdifferentiationofhpcMSCswasobservedundermicroscope

4 討論

二十世紀七十年代，Friedenstein等首先從成人骨髓中分離培養出間充質干細胞，隨著研究的深入，表明間充質干細胞具有分化能力強，倍增時間短，具有免疫調節作用和低下的免疫原性，易于轉染的特性，是再生醫學的一種理想種子細胞和基因治療載體[7-9]。而hpcMSCs比骨髓來源MSC更原始，免疫原性更低，受到再生醫學領域的廣泛關注[2,10]。

目前，hpcMSCs分離培養方法主要有組織塊法和胰蛋白酶消化法，整個過程操作繁瑣，容易污染，而且用胰蛋白酶處理時間太長，影響細胞活性和傳代能力[11]。本方法中，(1)只需用手工把絨毛膜組織剪成1～3 cm的小條塊，減少了人力的消耗和時間成本，一個工作日內完全可以處理完一個完整胎盤的絨毛膜。(2)用手持電動勻漿器處理至細小顆粒狀(約米粒大小)，用生理鹽水反復沖洗，能夠去除大部分胎血，再繼續用勻漿器處理至肉糜狀(稍有顆粒感，能夠用吸管自由吸取)；離心500 r/min，5 min，去除上清液。通過這個處理過程，基本上能夠去除胎血及其中的紅細胞。(3)用勻漿器處理后，組織塊變得很薄而且微小，增加了組織塊的分散度，提高了接種面積。(4)勻漿器處理后，組織成肉糜狀，減少了胰蛋白酶的消化時間，避免了對細胞的傷害。(5)接種前的沉淀為漿糊狀，組織塊相互粘連，使得加入培養基后不易漂浮，使得微小組織能夠有比較好的貼壁效果。新方法基本上結合了酶消化法和組織塊貼壁法的優點。

由于胎盤組織具有獨特、復雜的解剖結構，其內有大量交錯的血管網絡及結締組織，導致胎盤來源間充質干細胞不純，為胎盤血間充質干細胞和胎盤組織間充質干細胞的混合物。而且大量紅細胞的存在，也是胎盤間充質干細胞分離提取的障礙，阻止原代間充質干細胞的有效貼壁，減少原代間充質干細胞的數量或培養不成功[12-14]。本方法中，用勻漿器處理絨毛膜至米粒大小時，進行沖洗，能夠去除大部分胎血，處理至乳糜狀態時，再一次低速離心，使得胎血細胞保存在上清液中，有效去除了胎血細胞，減少了紅細胞對間充質干細胞貼壁的影響，提高了P0代細胞的均一性。整個過程簡便，不用增加新的試劑和處理程序，減少了污染可能。

本方法中，選用手持電動勻漿器作為一種基本實驗器材的原因如下：(1)易得：勻漿器基本功能是用于組織勻漿，方便提取細胞DNA，生物醫學實驗室普遍具有該器材，如果沒有，購買方便而且便宜，普通實驗室完全有能力購買。(2)方便：電動勻漿器使用方便，器材主體可以隨意移動和消毒，電動勻漿器的轉子可以進行滅菌處理。(3)過程容易掌握：整個過程肉眼可見，隨時調整處理程度。

綜上，新的hpcMSCs分離培養方法是結合了胰蛋白酶消化法和組織塊貼壁培養法的優點。該體系簡便、快捷，提高了原代hpcMSCs的產量，為建立臨床級hpcMSCs庫奠定基礎，可以為組織工程和基因治療載體提供足夠的、質量穩定可靠的間充質干細胞。