重組人神經生長因子真核表達載體構建及其在畢赤酵母中的表達與純化

黃志立，蔣偉，周燁，沈麗，王妍*

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重組人神經生長因子真核表達載體構建及其在畢赤酵母中的表達與純化

黃志立1，蔣偉1，周燁2，沈麗1，王妍1*

（1. 深圳職業(yè)技術學院 應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518055；2．吉林大學 分子酶學工程教育部重點實驗室，吉林 長春 130012）

研究構建了重組人神經生長因子（Recombinant human nerve growth factor，rhNGF）的一種真核表達載體，并轉化畢赤酵母GS115．在hNGF基因序列基礎上對其進行畢赤酵母偏好密碼子分析與改造，然后構建重組質粒pPIC9K-hNGF，經PCR、酶切及測序驗證后，轉化酵母，利用遺傳霉素篩選出高效表達rhNGF的重組酵母．表達產物經SDS-PAGE分析，結果見一條與hNGF分子質量15.7kDa相當?shù)臈l帶，蛋白表達量約為52.86%．將表達產物經初步純化和進一步精提后，純度超過98%．分別以鼠NGF產品和人NGF標準品為對照，利用TF-1細胞/MTS比色法檢測NGF活性，結果表明rhNGF具有良好的生物學活性，其活性和比活性分別為5.0U/mL和253U/mg，高于鼠NGF產品（2.6 U/mL，130U/mg），與hNGF標準品相當（5.0 U/mL，250 U/mg）．

重組；人神經生長因子；真核載體；畢赤酵母；生物活性

神經生長因子（Nerve growth factor，NGF）是最重要的神經系統(tǒng)生物活性分子之一，具有多種生物學功能，對調節(jié)中樞及周圍神經元的生長、分化以及對損傷神經的再生修復具有重要意義[1]．自1953年發(fā)現(xiàn)至今[2]，大量的研究表明NGF是保護和治療神經系統(tǒng)疾病的高效藥物，其主要應用的適應證有多種類型的周圍神經損傷、面神經炎、中小面積燒傷、帕金森綜合癥等[3]，近來的研究還發(fā)現(xiàn)NGF在褥瘡、角膜潰瘍、青光眼治療中發(fā)揮著積極的作用[4]．

目前上市的NGF產品主要從小鼠的頜下腺中提取，但鼠源NGF應用在人類疾病治療中可能存在誘發(fā)免疫反應、鼠源病毒交叉感染等危險，并且生產須依賴活體動物．而人hNGF在人體中含量極少，幾乎不可能作為產品的生產來源，因此生產重組基因工程rhNGF是可考慮的主要途徑．原核和真核表達系統(tǒng)各有其優(yōu)缺點，已有的研究表明rhNGF已經在大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞以及動物乳腺中獲得表達[3]，但均存在產量低、成本高、產品活性不穩(wěn)定等問題，國內至今沒有rhNGF產品上市．本課題組長期進行rhNGF的開發(fā)及產業(yè)化研究，利用多種表達系統(tǒng)來制備hNGF．本實驗構建一種可穩(wěn)定表達天然活性β-NGF的重組表達載體pPIC9K-hNGF，轉化至畢赤酵母GS115中，并從該細胞發(fā)酵液中分離純化出具有生物活性的重組人β-NGF，為制備人NGF 提供實驗基礎．

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑

GS115、DH5α為深圳市大規(guī)模細胞培養(yǎng)平臺實驗室保存；pPIC9K載體購自美國Novgen公司；質粒提取試劑盒、PCR試劑盒為北京索萊寶科技有限公司產品；DNA回收試劑盒為北京百泰克生物技術有限公司產品；T4DNA連接酶、限制性內切酶B I、I、I等購自大連寶生物技術有限公司；蛋白質純化層析柱均購自GE Healthcare公司；純化小鼠頷下腺神經生長因子由珠海麗珠集團提供（批號20150305）；hNGF標準品購自以色列prospecbio公司．其余試劑均為國產或進口分析純．引物合成、基因測序和蛋白質譜分析委托上海生工生物工程公司完成．

1.2 hNGF基因的密碼子優(yōu)化及pUC57-hNGF重組載體的構建

于NCBI中查找到的人β-NGF基因序列（NM 002506），利用www.gcua.de網站進行畢赤酵母表達hNGF密碼子偏好性分析，將其中畢赤酵母使用頻率很低的密碼子進行同義替換．同時，為便于后期成熟hNGF蛋白的分離純化，在hNGF編碼基因前添加了腸激酶識別位點（DDDDK）的編碼序列．將優(yōu)化好的序列委托上海生工生物工程公司進行全基因合成，并將其克隆至pUC57質粒上，得到了含有目的基因的重組載體pUC57-hNGF，經測序證實基因序列正確．

1.3 重組質粒pPIC9K-hNGF的構建

以pUC57-hNGF為模板，設計分別帶有限制性內切酶B I和I識別位點的引物（表1），采用PCR法擴增hNGF基因．為了便于目的蛋白的純化，上游引物中還加有編碼6×His的序列，使得最終表達hNGF的N端帶有6×His標簽和腸激酶識別位點．PCR循環(huán)反應條件為：94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，32個循環(huán)．將PCR產物用DNA回收試劑盒進行回收，限制性內切酶B I和I進行雙酶切并回收酶切片段，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測．同上操作，將質粒pPIC9K進行雙酶切，產物經回收檢測后，與目的片段進行連接，產物轉化DH5a感受態(tài)細胞，在含卡那霉素的平板上篩選到抗性菌落，提取質粒進行PCR和酶切鑒定并測序．

1.4 重組質粒pPIC9K-hNGF轉化畢赤酵母及鑒定

提取重組質粒pPIC9K-hNGF，經I酶消化成線性，將產物純化后備用．取80μL經冰凍山梨醇處理制成的畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞與5-20μg線性質粒DNA混合，冰育5min，放入電穿孔儀2000V/mm、5ms進行電激．取200μL處理液鋪MD平板，30℃過夜培養(yǎng)至菌落長出．挑取單菌落接種于微量測定板中（200μl YPD培養(yǎng)基/孔），輕輕攪動以懸浮細胞，30℃孵育2d后，吸取10μL培養(yǎng)液接種于新的每孔含190μL YPD培養(yǎng)基的微量測定板中，30℃孵育過夜，重復以上操作1次．準備10個YPD平板，分別加入遺傳霉素至其終濃度依次為0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0及4.0mg/mL，將微量測定板上每個孔中的菌液分別接種到10個抗性平板的對應區(qū)域中，30℃孵育2~5d，待抗性克隆出現(xiàn)．挑取酵母單克隆富集培養(yǎng)，提取酵母染色體DNA，PCR檢測陽性重組菌．PCR引物分別為特異引物（上游引物：TATACGGGATCCATGGACGATGATGAC；下游引物：ATACCGCTCGAGTTATCTCACAGCTT）和AOX通用引物（上游引物：GACTGGTTCCAATTGACAAGC；下游引物：GCAAATGGCATTCTGACATCC），PCR循環(huán)反應條件為：94℃，30s；50~60℃，30s；72℃延伸1000bp/min，32個循環(huán)，產物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測．

1.5 rhNGF的誘導表達和鑒定

接種重組酵母單菌落于25ml的BMGY培養(yǎng)基，28-30℃培養(yǎng)至OD600為2-6．3000r/min，離心5min，棄上清，用約100mLBMMY培養(yǎng)基重懸細胞至OD600約為1，28~30℃震蕩培養(yǎng)，每24h向加入甲醇至終濃度為0.5%以保持誘導表達．分別于0，24，48，72，96，120，144h取l mL培養(yǎng)物，離心，取發(fā)酵上清液，加入100μL三氯乙酸（TCA），振蕩混勻，4℃靜置30min，10000r/min離心10min，棄上清，沉淀中加入1mL-20℃預冷的丙酮，劇烈振蕩后，4℃，10000r/min離心10min，棄上清，重復丙酮處理步驟1次，樣品在室溫靜置30min后進行SDS-PAGE和質譜分析．

表1 用于擴增hNGF的PCR引物序列

1.6 rhNGF的純化

將10L培養(yǎng)液低溫離心15分鐘收集上清液，超濾濃縮；經Ni2+-Chelating Sepharose FF柱層析分離，上樣及洗脫流速為10~15mL/min．緩沖液C（20mmol/L TrisCl，0.75mol/L NaCl，pH8.0）充分洗脫平衡，上樣后分別用緩沖液C和緩沖液D（20mmol/L TrisCl，0.75mol/L NaCl，pH7.0）各沖洗3~5個柱體積，最后用緩沖液E（20mmol/L TrisCl，0.75mol/L NaCl，pH6.5，0.1mol/L咪唑）為洗脫液，收集的含有目的蛋白的洗脫峰，再經過Sephadex G-25柱層析，緩沖液F（50mmol/L Tris-HCl，pH8.5）收集的含有目的蛋白的洗脫峰，與50mmol/L Tris-HCl（pH8.0），2mmol/L CaCl2，0.2%Tween-20（過濾除菌）等體積混合，按1U腸激酶對20ug融合蛋白加入腸激酶，37℃水浴16h．酶切產物再次經過Ni2+-Chelating Sepharose FF螯合層析，酶切之后的hNGF在流穿峰下來收集，最后經過Sephacryl S-300層析，其中緩沖液為20mmol/L PB（pH6.8），上樣及洗脫流速為35mL/min．

1.7 rhNGF的活性測定

將層析收集得到rhNGF蛋白液進行SDS-PAGE電泳．hNGF活性測定采用中國藥典四部（2015版）規(guī)定的TF-1細胞/MTS比色法[5]，對照品分別為小鼠頷下腺神經生長因子（對照1）及hNGF標準品（對照2）．細胞初始濃度為3′105個/mL，NGF活力單位起始濃度為15μg/mL，按1/4倍比稀釋，培養(yǎng)48 h后分別經MTS染色于490 nm測吸光值，做兩參數(shù)擬合曲線．

2 結果與分析

2.1 重組質粒pPIC9K-hNGF的鑒定

以pPIC9K-hNGF為模板，利用表1中所示的引物進行PCR鑒定，電泳結果如圖1所示．目的基因大小為405bp，從圖1中可以看出兩個陽性克?。ㄓ镜?、2）PCR擴增出的條帶大小位置正確．利用限制性內切酶B I和I對重組質粒進行雙酶切鑒定，得到兩條片段大小分別為9259bp和398bp，結果與預期相符（圖2）．將該質粒委托上海生工生物工程公司進行測序，測序結果顯示hNGF基因與設計一致，在重組質粒構建過程中沒有發(fā)生突變．

M：Marker；1-2：Recombinant plasmid

M1-M2：Marker；1：Recombinant plasmid

2.2 畢赤酵母轉化子的PCR鑒定

經高濃度遺傳霉素篩選得到多拷貝轉化子畢赤酵母，提取其染色體DNA進行PCR鑒定，結果如圖3所示．使用hNGF特征引物進行PCR擴增，會得到大小約為400bp的條帶，圖3a中4個轉化子均擴增出hNGF基因．使用AOX引物進行PCR擴增的結果，會得到大小約為2000bp和900bp的2條基因，由圖3b可看出，4個轉化子的PCR檢測結果均與預期相符，以上結果表明重組質粒pPIC9K-hNGF成功以插入的方式整合到酵母基因組中．

2.3 重組酵母表達hNGF的SDS-PAGE和鑒定

將所篩選并鑒定后的重組畢赤酵母經甲醇誘導表達后，分別在不同時間取發(fā)酵上清液，用TCA-DOC法濃縮約60倍（900μL濃縮為15μL），將濃縮產物進行SDS-PAGE凝膠電泳．圖4為分別誘導48h、96h和144h后發(fā)酵濃縮液中蛋白電泳圖，目的蛋白的分子量約為15.7kDa，在相應位置處有明顯條帶；圖5為表達產物的質譜的分析結果，其分子量為13319.8，與預期相符，說明重組畢赤酵母分泌表達了hNGF．根據(jù)電泳掃描分析結果可知rhNGF的表達量約為59.66mg/L發(fā)酵液，占總蛋白的52.86%．

M：Marker；1-4：GS115 transformants

2.4 rhNGF的純化

將重組酵母經誘導96 h后的發(fā)酵液經初步純化后，采用了包括Ni螯合層析、酶切、脫鹽、第二次Ni螯合層析、Sephacryl S-300層析等工藝來精提目的蛋白hNGF．取三批純化后的hNGF蛋白進行SDS-PAGE電泳，結果如圖6所示．從結果看到三批蛋白純化后的目的蛋白在13.4kDa，表明酶切后成功得到目的蛋白，且純度分別為98.6%、100%和100%，據(jù)中華人民共和國藥典三部的規(guī)定，其純度超過95%為合格．

2.5 rhNGF的活性分析

取三批純化后重組hNGF樣品，采用中國藥典（2015版）規(guī)定的TF-1細胞/MTS比色法測定其活性，分別以小鼠頷下腺神經生長因子（對照1）和hNGF標準品（對照2）為對照，檢測過程中發(fā)現(xiàn)，rhNGF對細胞增殖有較為明顯的促進作用，且隨rhNGF活力單位的增加而加速增長，當rhNGF高于一定濃度（500U/ml）細胞增殖出現(xiàn)抑制．經該法檢測到的NGF樣品的活性結果見表2．

M：Marker；1-3：rhNGF expression of recombinant yeasts in 48，96 and 144h

圖5 重組酵母表達rhNGF的質譜分析圖譜

M：Marker；1-3：rhNGF after purification

從表2可見，利用本文表達系統(tǒng)表達和純化的目的蛋白，三批樣品的活性分別為4.8U/ml、5.3U/ mL和5.1U/ mL，平均為5.0U/ mL，三批樣品的比活性分別為240、265和255 U/mg，平均為253U/mg；而陽性對照品小鼠頜下腺提取的NGF標準品的活性為2.6U/ mL，比活性為130U/mg．hNGF標準品的活性為5.0 U/ mL，比活性為250 U/mg，說明本文經過改構基因表達的NGF活性基本達到基因原型表達的NGF活性水平，同時高于目前上市的動物提取的NGF．

表2 重組hNGF樣品和2種對照品的活性結果

3 討 論

NGF是Rita Levi-Montalcini等人對現(xiàn)代生物學的重要貢獻，該成果獲得1986年諾貝爾醫(yī)學生理學獎．NGF是一種多肽蛋白復合物，由數(shù)量不等的3種不同的亞基組成，分別為α亞基（2個）、γ亞基（2個）和β亞基（1個），其中β亞基是NGF的活性區(qū)，所以NGF現(xiàn)多指β-NGF．β亞單位是一種二聚體，其生物活性取決于三對二硫鍵，若二硫鍵結構不正確，NGF的將喪失其生物活性[3]．

NGF是各類神經損傷性疾病的高效藥物，也是目前唯一可應用于臨床的神經系統(tǒng)蛋白質因子，它的適應證隨著新的研究還在不斷擴大，2017年7月EMA批準了意大利Dompé公司的重組人神經生長因子滴眼液用于中重度神經營養(yǎng)性角膜炎治療．最近的研究發(fā)現(xiàn)，如果以滴眼液的形式給藥，可將NGF經視神經傳遞到視神經節(jié)細胞，并可穿過血眼屏障，實驗證明通過鼻和眼部局部能夠使NGF到達腦部．這些研究為NGF治療眼部疾病和中樞神經系統(tǒng)疾病提供了新的給藥途徑，使NGF的醫(yī)學價值變得更加凸現(xiàn)[4]．

鼠NGF與人NGF同源性高，可達90%．鼠NGF提取自小鼠頜下腺，提取工藝簡便，NGF活性也較高，故成為第一個上市的NGF．目前國內有四家企業(yè)生產鼠頜下腺提取的NGF，分別為“恩經復”（廈門北大之路生物工程公司）、“金路捷”（武漢海特生物制藥公司）、“蘇肽生”（ 北京舒泰神藥業(yè)）和“麗康樂”（珠海麗珠集團）．鑒于鼠NGF與人NGF在蛋白序列上存在10%的差異，容易誘發(fā)抗體反應，且存在交叉感染、生產依賴活體動物等缺點，人源性NGF才是藥用NGF更合理的來源，而利用基因工程生產rhNGF幾乎是開發(fā)hNGF藥物的唯一選擇．

蛋白質的原核和真核表達各有其優(yōu)缺點．文獻[6,7]利用表達rhNGF，但表達的外源蛋白多為包涵體，需要進行體外復性，而NGF中三對二硫鍵的存在很可能造成復性困難導致生物活性不穩(wěn)定，這些研究結果與我們早期研究結果相似．文獻[8,9]利用CHO細胞，文獻[10]利用HEK293細胞均實現(xiàn)了rhNGF在哺乳動物細胞中的表達．此外也有研究報道rhNGF可在昆蟲細胞[11]、動物乳腺[12]中表達．哺乳動物細胞在表達rhNGF的研究中具有獨特的優(yōu)勢，但比較而言表達量低、成本高，且由于hNGF特殊的分子結構，使得其產業(yè)化進程緩慢，至今仍無rhNGF產品上市．

酵母表達系統(tǒng)具有特別的優(yōu)勢，它既能克服原核系統(tǒng)不能對真核生物蛋白翻譯后修飾加工的缺陷，又具有易培養(yǎng)、成本低、表達量高等優(yōu)點，目前國內外相關報道較少．本課題組早在2007年就開展了利用畢赤酵母表達rhNGF的研究[13]，人工合成hNGF全基因組片段，構建了重組質粒pPIC9K/rhNGF，轉化畢赤酵母，得到具有一定表達量的重組酵母，但表達產物為融合蛋白，且融合蛋白的表達量也只約50%，后續(xù)純化工藝復雜．文獻[14]利用人胎盤DNA為模板PCR擴增出hNGF基因，利用pPIC9K載體構建了重組質粒，轉化甲醇酵母并對表達蛋白進行了電泳分析，但未就后續(xù)的表達進行研究．分析原因以上，可能與酵母表達系統(tǒng)對基因密碼子的偏好性有關，人源的NGF基因密碼子在酵母細胞里翻譯效率不高，導致表達量不理想．因此本研究在已有研究的基礎上，對hNGF的基因序列進行了畢赤酵母偏好密碼子改造，并且為便于外源蛋白的分離純化添加了腸激酶識別位點，所構建的重組酵母成功表達了rhNGF，表達量約為59.66mg/L發(fā)酵液，占總蛋白的52.86%，其表達量與李景傳等人的利用哺乳動物細胞表達hNGF的結果相當[10]．所表達蛋白經系列工藝純化后，純度超過95%，其活性相當甚至優(yōu)于市售鼠NGF商品及hNGF標準品．說明本研究中的基因密碼子改造在獲得了較好的表達量的同時，也未影響表達產品的天然結構和生物活性．與哺乳動物細胞表達結果相比，酵母在發(fā)酵和培養(yǎng)成本及工藝上具有明顯優(yōu)勢，該研究為rhNGF規(guī)模生產和臨床應用奠定了良好的實驗基礎．

[1] Minnone G, De F, Braccilaudiero L. NGF and Its Receptors in the Regulation of Inflammatory Response[J]., 2017，18（5）：1028-1035．

[2] Badowska-Szalewska E, Krawczyk R , Ludkiewicz B. The effect of mild stress stimulation on the nerve growth factor (NGF) and tyrosine kinase receptor A (TrkA) immunoreactivity in the paraventricular nucleus (PVN) of the hypothalamus and hippocampus in aged vs. adult rats[J].2015，290（2）：346-356．

[3] 沈麗，王妍．神經生長因子的研究及應用進展，微生物學免疫學進展[J]．2015，43（6）：48-52．

[4] Manni L, Rocco M L, Bianchi P, et al. Nerve growth factor: basic studies and possible therapeutic applications[J]., 2013，31（4）：115-122．

[5] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（四部，通則）[M]．2015：280．

[6] 姜靜，姜桂香．來源于和CHO表達系統(tǒng)的重組人β-NGF性質比較[J]．中國生物工程雜志，2006，26（2）：8-12．

[7] He L B，Wang Y，Wang G．Expression and purification of active recombinant human nerve growth factor from Escherichia coli[J]．, 2007，23（2）：237-240．

[8] 樂偉，彭璐佳，史權威，等．重組人神經生長因子的高效表達和生物活性評價研究[J]．中國藥事，2014，28（6）：601-606．

[9] 陳勇，蔣琳，楊軍，等．人β-NGF真核表達載體的構建及其表達產物的生物活性[J]．中國生物制品學雜志，2005，18（6）：457-460．

[10] 李景傳，薛博夫，袁媛，等．重組人神經生長因子rh-β-NGF真核表達載體的構建及其在HEK293細胞中的表達[J]．生物工程學報，2015，31（3）：411-420．

[11] 李佳楠，王玲，呂新凱，等．重組人β-神經生長因子在昆蟲細胞中的表達、純化及其生物學活性[J]．中國生物制品學雜志，2013，26（3）：332-335．

[12] Xiao B，Li Q W，F(xiàn)eng B，et al．High-level expression of recombinant human nerve growth factor beta in milk of nontransgenic rabbit[J]．，2008，105（4）：327-334．

[13] 王革，王妍，孫海波，等．酵母分泌表達重組人神經生長因子[J]．食品與藥品，2007，9（1）：9-11．

[14] 舒紅，任常山．甲醇酵母高表達人神經生長因子的檢測及意義[J]．中華檢驗醫(yī)學雜志，2004，27（1）：37．

Construction of Recombinant Human Nerve Growth Factor Eukaryotic Vector and Its Expression and Purification in Yeast

HUANG Zhili1, JIANG Wei1, ZHOu Ye2, SHEN Li1, WANG Yan1

（）

In this study, a recombinant plasmid vector was constructed, which can efficiently express human nerve growth factor (rhNGF) inGS115. First, gene sequences of hNGF were modificated based on codon usage bias of. The recombinant plasmid of pPIC9K-hNGF was constructed and its gene sequences were confirmed by PCR, restriction endonuclease digestion and sequencing. SDS-PAGE analysis revealed that the expression product owned a molecular weight of about 15.7 kDa with a protein express amount of 52.86%. After being purified by multiple separate processes, the hNGF protein was yielded with a purity of more than 98%. Biological activities of rhNGF were detected by TF-1 cells /MTS method in contrast with mouse NGF product and hNGF standard sample. Results showed that both biological activities and specific activities of rhNGF (5.0ng/mL, 253U/mg) were superior to mouse NGF product（2.6 ng/mL，130U/mg）and similar to hNGF standard sample（5.0 ng/mL，250 U/mg）.

recombinant; human nerve growth factor (hNGF); eukaryotic Vector;; biological activities

10.13899/j.cnki.szptxb.2018.05.007

2018-05-10

廣東省教育廳產學研結合資助項目（2012B091100408）和廣東省深圳市創(chuàng)新委新興產業(yè)公共技術服務平臺資助項目（GGJS20130331152344401）

黃志立（1974-），女，四川興文縣人，副教授，博士，主要從事生物技術應用研究．

王妍，博士，研究員，從事生物制品的研究開發(fā)（E-mail：wangsusan@szpt.edu.cn）．

R346；Q78

A

1672-0318（2018）05-0041-06