RNA解旋酶DDX3與轉移性乳腺癌預后關系的研究

胡金飛，胡望遠

(金華市中心醫院放療科，浙江 金華 321000)

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，該病的發病原因至今尚未明確，可能與患者的遺傳、環境因素、心理情志因素等有關，近年發病率呈升高的趨勢，其死亡率占女性腫瘤的第二位，且呈低齡化發展[1]。據統計約10%的患者確診時已合并有遠處轉移(TNM分期 Ⅳ期)[2]，約30%的轉移性乳腺癌(metastatic breast cancer，MBC)患者生存期超過5年，10%的患者生存期超過10年[3]。針對已經發生遠處轉移的乳腺癌患者行原發病灶切除應對遠期療效具有積極影響，因此，本次研究入選的所有患者均進行原發病灶的切除以期觀察預后情況。RNA解旋酶DDX3是DEAD box家族成員之一，參與mRNA的轉錄和翻譯，有研究報道其與多種惡性腫瘤如乳腺癌、肺癌、肝癌、結直腸癌等有關，有可能作為潛在的治療靶點[4]。目前關于DDX3與轉移性乳腺癌的預后關系研究尚未見報道，因此，本文研究RNA解旋酶DDX3在轉移性乳腺癌中的表達情況，為轉移性乳腺癌患者的預后判斷提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料

本次研究的患者為2010年1月至2012年6月期間就診金華市中心醫院確診為轉移性乳腺癌的83例患者，年齡范圍35～74歲，平均年齡(51.25±2.41)歲，原發病灶經穿刺活檢及病理組織切片檢測確認，轉移病灶經計算機斷層掃描(computed tomography, CT)、核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)、放射性核素掃描確認。所有患者書面簽署知情同意書并經醫院倫理委員會審批通過后開展本次研究。入選標準：初次就診經穿刺活檢及病理組織切片檢測確認為轉移性乳腺癌患者，術前未進行過放化療，預計生存期3個月以上，具備完整的病例和臨床資料包括隨訪資料完整，無其他嚴重臟器功能及慢性疾病，血液學檢查各項指標基本正常，東部腫瘤協作組(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)評分≤3分。排除標準：復發轉移乳腺癌患者，顱腦轉移者，術前進行過放化療者，妊娠或精神病史者，哺乳期婦女，生存期預計3月以內者，臨床資料和隨訪資料不完整者，不配合完整治療者，合并有其他惡性腫瘤及慢性疾病者。

1.2 治療方法

入選的83例轉移性乳腺癌患者，均進行原發病灶組織切除，術后19例患者僅進行放療，其余64例患者均進行相應個體化放療+化療。所有入選的患者均采用電話或門診隨訪的方式，截止日期為2017年7月31日，平均隨訪時間為(47.3±2.7)個月，隨訪內容主要為患者術后3年的復發情況、生活情況等。

1.3 試驗方法

采用反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)方法檢測RNA解旋酶DDX3的表達，具體方法為：于術中取83例患者的癌組織和癌旁組織各30mg，經常規石蠟包埋后供檢測使用，檢測時經液氮吹打成粉末狀，加Trizol試劑提取總RNA，經分光光度計測總RNA后行逆轉錄，具體操作步驟按照逆轉錄試劑盒(Prime-ScriptTM，美國)說明書進行，經30℃10min、55℃35min反應后置于-80℃冰箱保存備用，PCR擴增體系及擴增條件為：1.5μL濃度為25mmol/L的MgCl2，2μL濃度為2.5mmol/L的dNTP，各1.25μL的PCR引物，2μL的DNA模板，0.5μL Tag DNA合成酶、2.5μL的10倍緩沖液，其余均用雙蒸水加至25μL，先于95℃預變性3min，再94℃變性30s，55℃退火37s，72℃延伸30s，共33個循環，最后72℃延伸3min。DDX3的表達量采用2表示。

1.4統計學方法

2結果

2.1 RNA解旋酶DDX3在轉移性乳腺癌組織中的表達及與臨床病理特征的關系

通過RT-PCR檢測結果顯示，RNA解旋酶DDX3在轉移性乳腺癌組織中的表達(0.49±0.06)顯著高于癌旁組織的表達量(0.23±0.02)(P<0.05)。同時，RNA解旋酶DDX3在轉移部位、轉移部位數、雌激素受體/孕激素受體(estrogen receptor/progesterone receptor，ER/PR)狀態臨床因素中表達存在明顯差異(均P<0.05)，而在年齡、是否絕經、癌組織類型臨床因素中不存在明顯差異(均P>0.05)，見圖1和表1。

圖1 RNA解旋酶DDX3在轉移性乳腺癌組織及癌旁組織中的表達情況

Fig.1 Expression of RNA helicase DDX3 in metastatic breast cancer tissues and adjacent tissues

因素例數(n)DDX3表達量t/FP年齡(歲)1.4320.149 <50310.49±0.04 ≥50520.43±0.04是否絕經0.9140.206 是630.49±0.06 否200.47±0.03癌組織類型1.1070.163 浸潤性導管癌450.50±0.04 浸潤性小葉癌270.49±0.03 其他110.49±0.02轉移部位8.0130.003 軟組織170.40±0.03 淋巴結230.54±0.04 內臟轉移210.39±0.03 骨轉移220.37±0.03轉移部位數9.2270.001 1～2510.37±0.04 ≥3320.52±0.04ER/PR狀態8.2460.002 陰性340.39±0.03 陽性490.52±0.04

2.2 DDX3的表達水平與轉移性乳腺癌患者術后復發的關系

DDX3的表達水平≥0.45在術后3年的復發率明顯高于其表達水平<0.45者(P<0.05)。同時，DDX3的表達水平≥0.45者的平均復發時間也短于其表達水平<0.45者，兩組差異均具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3 ROC曲線分析DDX3的表達水平與轉移性乳腺癌患者復發診斷的預測價值

根據ROC曲線分析得到：RNA解旋酶DDX3的表達對轉移性乳腺癌術后復發診斷的曲線下面積AUC為0.813(95%CI:0.702～0.906)，靈敏度為0.787，特異度為0.869，具體見圖2。

圖2 ROC曲線分析DDX3的表達水平與轉移性乳腺癌患者復發診斷的預測價值研究

Fig.2 Predictive value of DDX3 expression on recurrence of metastatic breast cancer analyzed by ROC curve

2.4轉移性乳腺癌患者臨床病理資料與生存率關系的單因素分析

轉移性乳腺癌患者術后3年、5年的生存率分別為45.85%、25.37%，將患者臨床資料與生存率進行單因素分析結果顯示，轉移部位、轉移部位數、術后輔助放化療、DDX3表達量是影響患者3年、5年生存率的影響因素(P<0.05)，具體見表3、圖3。

Table 2 The relationship between DDX3 expression level and recurrence rate and recurrence time of metastatic breast cancer

表3 轉移性乳腺癌患者臨床病理資料與生存率關系的單因素分析[n(%)]

(轉下表)

(續上表)

因素例數(n) 3年生存情況(n=38) 5年生存情況(n=21) 生存率χ2P生存率χ2P癌組織類型1.2180.1161.1030.205 浸潤性導管癌4520(44.44)15(33.33) 浸潤性小葉癌2712(44.44)5(18.52) 其他116(54.55)1(9.09)轉移部位8.4330.0049.2160.002 軟組織177(41.17)2(11.76) 淋巴結2311(47.83)9(39.13) 內臟轉移2113(61.90)8(38.09) 骨轉移227(31.82)2(9.09)轉移部位數5.8730.0255.7970.028 1～25127(52.94)18(35.29) ≥33211(34.38)3(9.38)ER/PR狀態3.1120.0652.5320.074 陰性3418(52.94)11(32.35) 陽性4920(40.82)10(20.41)術后輔助放化療6.1140.0215.8400.032 放療+化療6429(45.31)19(29.69) 放療199(47.37)2(10.53)DDX3的表達量8.7740.0036.8930.011 ≥0.455119(37.25)9(17.65) <0.453219(59.38)12(37.50)

圖3利用Kaplan-Meier法分析影響轉移性乳腺癌生存率的影響因素

Fig. 3 Influencing factors of survival rate for metastatic breast cancer analyzed by Kaplan-Meier

2.5轉移性乳腺癌患者預后多因素分析

將患者臨床病理資料與患者5年生存情況單因素分析中有統計學意義的因素作為因變量，預后5年生存情況為自變量進行Cox風險比例回歸模型分析，分析結果得到轉移部位、轉移部位數、DDX3表達量升高是轉移性乳腺癌患者預后的獨立危險因素，術后進行輔助放化療是患者預后的保護因素(P<0.05)，見表4。

表4 轉移性乳腺癌患者預后多因素分析

3討論

3.1乳腺癌治療和預后判斷進展

乳腺癌是女性中常見的惡性腫瘤，在我國每年有近17萬女性罹患乳腺癌，近年該病的發病率和死亡率均明顯上升[5]。據流行病學統計，乳腺癌易發在45歲以上的患者尤以絕經后女性為多見，70%以上組織學類型為浸潤性導管癌[6]，本次入選的轉移性乳腺癌患者中絕大多數以浸潤性導管癌為主且以絕經后女性為主，部分符合既往的主流報道。但有研究指出[7]，年輕患者易出現淋巴結轉移，經治療后極易出現復發轉移，但是我們本次研究通過對入選患者的分析發現出現復發轉移的患者仍以50歲以上患者居多，這與既往的報道不一致。Puig-Vives等[8]和Elkablawy等[9]報道指出疾病的分子分型是預后的獨立危險因素，本次研究中DDX3的表達水平在ER/PR陰性與陽性組間表達存在差異，但是患者3年、5年生存率在ER/PR陰性與陽性組間無明顯差異，不具有統計學意義(P>0.05)。發生轉移的患者主要以淋巴轉移、骨轉移及內臟轉移為主，轉移部位數較多者預后明顯較差。

3.2 DDX3對乳腺癌臨床預后的判斷作用

DDX3是DEAD盒蛋白RNA解旋酶家族一員，參與RNA代謝的重要過程，已有研究顯示它與多種惡性腫瘤的發生發展有關，參與細胞周期及凋亡的調控，在肝細胞癌中的表達明顯高于癌旁組織[4,10]。本研究顯示DDX3在轉移性乳腺癌的癌組織中表達明顯高于癌旁組織(P<0.05)，可能的機制是乳腺癌發生轉移時，癌細胞的細胞周期及細胞凋亡過程失常，導致參與細胞周期及細胞凋亡調控的DDX3表達上調。此外，DDX3的表達水平≥0.45在術后3年的復發率明顯高于其表達水平<0.45者，同時，DDX3的表達水平≥0.45者的平均復發時間也短于其表達水平<0.45者，提示DDX3的高表達預示轉移性乳腺癌的預后較差。臨床病理資料與3年、5年生存率的單因素分析結果顯示，轉移部位、轉移部位數、術后輔助放化療、DDX3表達量是影響患者3年、5年生存率的影響因素(P<0.05)，但Cox多因素分析結果得到術后輔助放化療是患者預后的保護因素，而轉移部位、轉移部位數、DDX3表達量是患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。 已有報道證實，疾病的臨床分期每增加一期，患者死亡的風險便增加數倍[2，11]。本次研究中轉移性乳腺癌患者已處于晚期，DXX3的診斷效果依然明顯。利用ROC曲線分析得到DDX3對轉移性乳腺癌患者術后3年復發的診斷具有良好的靈敏度和特異度。

綜合以上分析結果，對于轉移性乳腺癌患者檢測其DDX3的表達對患者預后的評估具有重要的意義，可為臨床醫生選擇更優的治療方案提供參考依據，也為臨床開發靶向治療藥物提供一定的方向。