中藥玄參對甲狀腺癌SW579細胞增殖及BCL-2和C-myc表達的影響

★ 伍慶華 李龍雪 宋渺渺 閔建新（江西中醫藥大學基礎醫學院 南昌 330004）

甲狀腺癌是內分泌系統最常見的惡性腫瘤之一［1］，絕大部分都起源于濾泡的上皮細胞。甲狀腺惡性腫瘤的發病機制目前不明確，與其相關的因素包括很多方面，但都有BCL-2與 C-myc的過度表達有關［2］。不同類型的甲狀腺癌，其生物學的特性和臨床表現、診斷及其治療和預后均有所差異［3-4］。

中醫學認為甲狀腺癌的發生多與情志不暢、肝郁氣滯或痰濕凝聚有關。司富春等［5］將近幾十年的成方經歸類后發現治療甲狀腺腫瘤多以清熱化痰、滋陰涼血［6-7］及疏肝解郁為治法，且特別重視疏肝解郁和滋陰養血藥物的選用。滋陰中藥玄參在臨床上應用已經有很久的歷史，清熱涼血、能清營血分之熱；養陰生津，能清熱邪而滋陰液?，F代中醫臨床及實驗研究表明，中藥玄參對食管癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、淋巴瘤等腫瘤具有較好的臨床療效。

本研究以甲狀腺癌SW579細胞為研究對象，從細胞凋亡的角度探討玄參抗甲狀腺癌的機制，為玄參治療甲狀腺癌提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 材料 甲狀腺癌細胞株（SW579細胞，2015年購于上海細胞庫）；玄參（江西藥都樟樹中藥飲片有限公司，批號：2015106000）；二甲基亞砜（DMSO，德國Sigma公司）；DMEM培養基（美國GIBCO12800-82）；四甲基偶氮唑藍（MTT，美國Amresco公司）；牛血清（FBS，美國ExCell Biology FSS500）；溴化乙錠（EB，BioBasic INC（BBI）；Transzol試劑（北京全式金生物技術有限公司）；TranScript first-strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；2×EasyTaq PCR SuperMix試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）。

1.2 主要儀器 2-16K高速低溫離心機（德國Sigma公司）；-80℃冰箱（美國Thermo Forma公司）；3111型CO2培養箱（美國Thermo Forma公司）；CX41型倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS）；SZK型醫用超凈工作臺（蘇州空氣凈化技術有限公司）；精密電子天平（Mettler Toledo Group）；MK3型酶標儀（奧地利Anthos公司）。

2 方法

2.1 玄參提取液的制備 向玄參水煮液中加入95%乙醇至藥液含醇量為50%，密封4℃冷藏48h后濾過，并用95%乙醇洗滌沉淀，收集濾液，濾液經真空減壓回收得深棕色浸膏。

2.2 MTT法檢測各藥物組細胞抑制率 將SW579細胞加入含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37℃無CO2培養箱內培養。將處于對數生長期的細胞消化后制成單細胞懸液，密度為8×104個 /μL接種于 96孔板中，100μL/孔。細胞培養24h后，加入不同濃度中藥玄參提取液（玄參濃度 100μg/μL，1/2 倍梯度減至 0.09765625μg/μL）；48h后用PBS小心漂洗2次，每孔加入完全培養基100μL及MTT10μL；繼續培4h后吸棄上清，每孔加入DMSO 100μL，于全自動酶標儀上震蕩10min使結晶完全溶解，在波長490nm下測定吸光度A值。

2.3 實驗分組 根據IC值取玄參濃度3.125μg/μL、0.390625μg/μL、0.09765625μg/μL 三個組別作為高中低濃度組，陰性對照組：培養液中只有細胞無藥物。

2.4 Real-Time PCR檢測BCL-2和C-myc表達水平 將不同濃度玄參提取液孵育的SW579細胞提取總RNA進行RT-PCR分析。PCR引物均由南京金斯瑞科技有限公司設計合成，引物純化方式：PAGE；引物序列及PCR產物大?。簈hGAPDH primer（115bp）、Sense primer：5-CATCTTCTTTTGC GTCGCCA-3、Antisense primer：5-TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC-3，qhBCL2 primer（81bp）、Sense primer：5-ATCCAGGATAACGGAGGC-3、Antisense primer：5-CAGCCAGGAGAAATCAAAC -3、qhC-myc primer（119bp），Sense primer：5-GGCTCCTGGCAAAAGGTCA-3、Antisense primer：5-CTGCGT AGTTGTGCTGATGT-3實驗過程按試劑盒說明書進行，反應結束后，取PCR產物5μL于2%瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠成像系統進行掃描并用Image J軟件分析圖像。

2.5 統計學方法 用SPSS 16.0統計軟件，采用單因素方差分析及顯著性，兩兩比較采用LSD法。數據均采用均數±標準差（）表示，P＜0.05，

有統計學意義；P＜0.01，有顯著統計學意義。

3 結果

3.1 不同藥物濃度抑制率的比較 通過MTT實驗，不同藥物濃度的實驗組與對照組數據相比，通過t檢驗，P值均＜0.05。由此可得，玄參提取液隨著濃度的升高，對甲狀腺SW579細胞生長的抑制率也越高，與對照組相比差異均有統計學意義，且玄參提取液對細胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性。見表1。

表1 48h玄參提取液對SW579細胞增值的影響（）

表1 48h玄參提取液對SW579細胞增值的影響（）

注：與對照組比較，*P＜0.01 ；與上一組高濃度比較，#P＜0.01

組別 均值/標準差 抑制率/%對照組 0.746±0.017 -空白組 0.0451 -玄參 100μg/μL 0.087±0.008* 88.34玄參 50μg/μL 0.158±0.011*# 78.82玄參 25μg/μL 0.205±0.014*# 72.55玄參 12.5μg/μL 0.262±0.012*# 64.85玄參 6.25μg/μL 0.324±0.021*# 56.54玄參 3.125μg/μL 0.387±0.011*# 48.18玄參 1.5625μg/μL 0.412±0.02*# 44.83玄參 0.78125μg/μL 0.525±0.005*# 29.62玄參 0.390625μg/μL 0.604±0.02*# 19.06玄參 0.1953125μg/μL 0.651±0.01*# 12.76玄參 0.09765625μg/μL 0.672±0.02*# 9.89

3.2 各組BCL-2mRNA的表達與C-myc mRNA表達比較 低濃度組、中濃度組和高濃度組BCL-2 mRNA與C-myc mRNA表達水平均低于對照組（P＜0.01），中濃度組和高濃度組BCL-2 mRNA與C-myc mRNA表達水平均低于低濃度組（P＜0.01），高濃度組BCL-2 mRNA與C-myc mRNA表達水平低于中濃度組（P＜0.01）。見表2。

表2 玄參提取液對SW579細胞增殖的影響（）

表2 玄參提取液對SW579細胞增殖的影響（）

注：與對照組比較，*P＜0.01 ；與低濃度比較，#P＜0.01；與中濃度比較，△P＜0.01。

組別 BCL-2 C-myc對照組 0.278586287±0.0110452 1.000309831±0.0304504玄參 0.09765625μg/μL 0.211683754±0.010071* 0.749320631±0.0329353*玄參 0.390625μg/μL 0.154137237±0.0066958*# 0.518559426±0.0152854*#玄參 3.125μg/μL 0.080030921±0.003226*#△ 0.214025643±0.0142201*#△

4 討論

多年以來，國內外學者對中藥玄參的化學成分進行過廣泛的研究，在已有的研究結果中表明顯示，玄參中最主要的是苯乙醇苷和含環烯醚萜兩類化學成分［8］，此外，還有三萜皂苷、黃酮類、有機酸、脂肪酸和揮發油等其他類型的化合物［9］。中醫成方經歸類后發現治療甲狀腺腫瘤多以清熱化痰、滋陰養血、疏肝解郁為治法，玄參作為清熱涼血、養陰生津的藥物使用頻次特別高。

甲狀腺癌為常見的內分泌系統惡性腫瘤。在多種致癌因素的作用下，原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及參與細胞增殖與分化調控的細胞周期調控因子的變化等都與腫瘤的發生發展密切相關。目前對甲狀腺癌相關基因的研究領域，主要集中在酪氨酸激酶受體基因的重排（RET／PTC）、C-myc、BCL-2、c-fos、Rb 基因等方面［10］。

BCL-2可抑制細胞凋亡、促進細胞存活的功能，可通過調節細胞的凋亡參與腫瘤的發生與發展；實驗結果顯示玄參作用于SW579細胞后能下調細胞中BCL-2的表達，導致SW579細胞的增殖受抑制。C-myc是常見的原癌基因，參與細胞從G1期進入S期的生理過程［11］，抑制C-myc基因表達可以抑制腫瘤細胞的增殖；實驗結果顯示，玄參能下調SW579細胞中C-myc的表達，導致甲狀腺癌細胞增殖的抑制。MTT實驗的結果還顯示，玄參提取液對SW579細胞增殖的抑制效果呈濃度依賴性。但是本實驗只有玄參提取液對甲狀腺癌細胞體外實驗方面進行了初步探討，并非符合人體藥代動力學的特征。因此要更準確了解玄參抗腫瘤的機制還需要完善動物實驗，進一步了解藥物在體內對細胞作用的機理。