淺析熒光實時定量PCR法檢測流感病毒核酸的質控結果

張秀華

【摘要】目的：為進一步提高本單位在使用熒光實時定量PCR法檢測流感病毒核酸方面的檢驗水平。方法：對本單位的熒光實時定量PCR法檢測流感病毒核酸的質控考核結果進行分析。結果：在本次質控考核實驗中，檢出流感病毒甲1型和流感病毒甲3型，根據分子生物考核操作標準，本單位使用熒光實時定量PCR法檢測流感病毒核酸方面的檢驗情況合格。結論：熒光實時定量PCR法在檢測流感病毒核酸方面具有廣泛的應用空間，可以為一些突發性公共性事件的檢驗提供準確的數據，值得進一步推廣。

【關鍵詞】熒光實時定量PCR法；流感病毒核酸；質控

【中圖分類號】R466

【文獻標志碼】A

【文章編號】1005-0019（2018）09-110-01

熒光實時定量PCR法的臨床應用，最大程度改善了傳統PCR法特異性不強、污染的問題，并通過電腦軟件的配合性應用[1]，實現了在每一輪循環都可檢測出一次熒光信號強度，進而獲得標準曲線獲得定量的檢測結果。目前，熒光實時定量PCR法在臨床疾病診斷、動物疫病檢測、食品安全等領域已經發揮出重要作用。為進一步提高本單位在使用熒光實時定量PCR法檢測流感病毒核酸方面的檢驗水平。本文特對本單位的熒光實時定量PCR法檢測流感病毒核酸的質控考核結果進行分析。

1實驗材料和方法

11實驗材料流感病毒滅活抗原標本三份、流感病毒RNA提取液、流感病毒核酸熒光PCR法檢測試劑盒（甲1型流感病毒、甲3型流感病毒、乙型流感病毒）、流感病毒核酸熒光PCR法檢測1μl9混合液、1μl混合酶、5μl處理完畢樣本，25μl反應體系。實時定量熒光檢測儀（型號為7300）、冷凍離心機（型號為38R）。

12方法

121實驗操作標準參照分子生物考核操作標準[2]、熒光實時定量PCR法操作規程流程進行實驗操作。

122具體實驗步驟

1221提取流感病毒核酸RNA將流感病毒裂解液500μl和流感病毒培養液100μl加入到15ml離心管中，混合充分后加入乙醇溶液（70%）600μl，取出RNA提取柱將600μl混合液加入，使用冷凍離心機進行15秒離心處理，設定離心速率為（12000rpm），棄去收集管液體[3]，在進行15秒離心處理，設定離心速率為（12000rpm），再棄去收集管液體，加入清洗液RW1700μl，進行15秒離心處理，設定離心速率為（12000rpm），取一干凈收集管移取RNA提取柱，在柱中加入清洗液RPE500μl，進行15秒離心處理，設定離心速率為（12000rpm），棄去收集管液體，再次加入清洗液RPE500μl，進行3分鐘離心處理，設定離心速率為（13000rpm），取出提取柱，移到一支15ml干凈離心管中，在柱中加入無核糖核酸酶水50μl，在20攝氏度室溫下放置2分鐘后，進行1分鐘離心處理，設定離心速率為（12000rpm），拋棄提取柱，即得流感病毒核酸RNA，在20攝氏度下保存待用。

1222擴增流感病毒甲1型核酸熒光PCR法檢測19μl混合液、1μl混合酶、5μl處理完畢樣本，25μl反應體系，選擇VIC熒光檢測通道[4]。流感病毒甲3型核酸熒光PCR法檢測19μl混合液、1μl混合酶、5μl處理完畢樣本，25μl反應體系和流感病毒乙型核酸熒光PCR法檢測19μl混合液、1μl混合酶、5μl處理完畢樣本，25μl反應體系選擇FAM熒光檢測通道。擴增時，注意蓋好PCR反應蓋，設定PCR擴增反應的條件[5]為：10分鐘45攝氏度—15分鐘95攝氏度15秒、60攝氏度60秒循環，反復循環擴增50次，根據基線最后取3個到15個循環熒光信號值。

1223結果判定標準當Ct閾值大于等于40時表示結果為陰性，當Ct閾值小于40時表示結果為陽性。

2結果

在本次質控考核實驗中，檢出流感病毒甲1型和流感病毒甲3型，根據分子生物考核操作標準，本單位使用熒光實時定量PCR法檢測流感病毒核酸方面的檢驗情況合格。

3討論

熒光實時定量PCR法，是指在PCR的反應體系中加入特有的熒光基團，通過對熒光信號的實時積累信號檢測對PCR反應過程進行有效監測，再使用相應電腦軟件進行標準曲線的繪制，最終達到對制定目標的定量分析。熒光實時定量PCR法的臨床應用顯著提高了傳統PCR法檢測的缺點，經臨床使用發現具有快速、穩定、安全、操作簡便、重復性高的諸多優點，由于其整個實驗過程都是在一個相對封閉環境中進行的，所以大大降低了污染的風險。但是在實踐操作中我們也發現，熒光實時定量PCR法也存在一定顯著的缺點，例如：對實驗操作的要求比較高，需要操作人員數量掌握相關原理、步驟、要點，并且影響實驗的因素也比較多，需要環境溫度等因素相對穩定，此外實驗成本比較高，在基層普及中存在一定困難。分析本次質控考核實驗結果，本次試驗檢出流感病毒甲1型和流感病毒甲3型，根據分子生物考核操作標準，本單位使用熒光實時定量PCR法檢測流感病毒核酸方面的檢驗情況合格。其中流感病毒乙型核酸未被檢測出來，分析原因認為和實驗試劑濃度有一定關聯，但需要進一步驗證。綜上所述，熒光實時定量PCR法在檢測流感病毒核酸方面具有廣泛的應用空間，可以為一些突發性公共性事件的檢驗提供準確的數據，值得進一步推廣。

參考文獻

[1]龍春平，孔令軍，吳周建，熒光實時定量PCR法檢測流感病毒核酸的質控結果分析[J]，中國衛生檢驗雜志，2008，18（6）：1107—1108

[2]張弛宇，李全雙，孫金燕，等，熒光實時定量PCR的研究進展[J]，江蘇大學學報，2006，16（3）：268—270

[3]羅淑華，黃勝中，李宇聰，等，熒光實時PCR檢測法在突發公共衛生事件的應用[J]，中國衛生檢驗雜志，2008，18（12）：2611—2754

[4]劉繼峰，關翠萍，徐田紅，等，單純皰疹病毒2型ICP4基因熒光實時定量PCR檢測方法的建立[J]，醫學研究雜志，2008，37（12）：36—38

[5]陶志華，謝耀盛，陳曉東，等，不同標本對熒光實時定量PCR法測定HBV-DNA結果的影響[J]，臨床檢驗雜志，2001，19（6）：345—346