飼料微生態(tài)產(chǎn)品中糞腸球菌含量檢測方法的建立

武鳳嬌，韓鐫竹，高 鐸，李欣南

（遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，遼寧 沈陽 110016）

飼用微生態(tài)制劑是作為飼料添加劑直接添加使用的微生態(tài)制劑[1]，作為一種新型綠色飼料添加劑，在養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)揮了重要作用[2-3]。歐盟等發(fā)達國家的微生態(tài)制劑產(chǎn)品銷量可觀，在抗生素替代產(chǎn)品的研發(fā)中已經(jīng)走在了世界的前列[4]。其作用機理主要有促進腸道優(yōu)勢菌群形成、提高免疫力、保持腸道微生態(tài)平衡、提高生產(chǎn)性能、改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)和改善養(yǎng)殖環(huán)境等[5-6]。除此之外，微生態(tài)制劑無毒副作用、無藥物殘留、能夠產(chǎn)生天然抗生素、有效抑制微生物生長繁殖，有利于機體健康[7-11]。

近年來，我國飼用微生態(tài)制劑產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展。在我國《飼料添加劑品種目錄》中已收載了34種允許使用的微生物菌種。這些菌種能夠?qū)暳现械睦w維變軟，提高飼料的轉(zhuǎn)化率，明顯提高飼料品質(zhì)[12-18]。但是由于新興產(chǎn)業(yè)市場不成熟，存在以下幾點問題：首先產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，企業(yè)檢測能力各不相同；其次標(biāo)準(zhǔn)制定水平相對滯后，導(dǎo)致方法的適用范圍狹窄，應(yīng)用性較差；再次微生態(tài)制劑產(chǎn)品的檢測標(biāo)準(zhǔn)仍處于空白狀態(tài)，導(dǎo)致市場監(jiān)督缺位。為規(guī)范微生態(tài)制劑產(chǎn)品的生產(chǎn)與使用，填補微生態(tài)制劑產(chǎn)品檢測的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)空白。本試驗針對市場常見的飼用微生態(tài)制劑品種中的糞腸球菌進行了含量檢測方法的研究。本檢測方法對糞腸球菌的檢測方法研究與地方標(biāo)準(zhǔn)的制定具有重要意義。

1 試驗材料

1.1 菌株來源質(zhì)控菌株為ATCC29212，購自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司；試驗菌株為不同企業(yè)的含有糞腸球菌的微生態(tài)制劑產(chǎn)品。

1.2 稀釋液、培養(yǎng)基及試劑0.85%滅菌生理鹽水、糞腸球菌培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、革蘭染色液、革蘭氏陽性菌鑒定卡或生化鑒定試劑。

1.3 設(shè)備和玻璃器皿 恒溫培養(yǎng)箱（精度36±1℃）、玻璃或塑料平皿（90 mm）、L形玻璃或塑料涂布棒、吸管或移液器（0.1 mL、1 mL、10 mL）、廣口瓶或三角瓶（500 mL）、離心管（50 mL）、高壓滅菌鍋、微生物鑒定系統(tǒng)、振蕩器、渦旋儀、麥?zhǔn)媳葷醿x、顯微鏡。

2 試驗方法

2.1 確證試驗使用商業(yè)化的生化鑒定試劑盒或生化鑒定管，對糞腸瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物進行生化鑒定，按說明書操作進行。也可使用微生物鑒定系統(tǒng)進行生化確證試驗。

2.1.1 菌種制備 自平板上挑取單菌落，劃線轉(zhuǎn)接培養(yǎng)于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，36±1℃培養(yǎng)48±2 h，從每一平板中選取至少1個良好分離的特征菌落，轉(zhuǎn)接保存，進行生化確證試驗。

2.1.2 細(xì)菌DNA提取 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進行細(xì)菌DNA提取，按照試劑盒步驟操作，通過微量紫外分光光度計進行DNA含量測定，所提取的的DNA濃度均＞100 ng/μL，A260/A280值均在1.8～2.0之間，滿足后續(xù)試驗的要求。細(xì)菌DNA提取液于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 形態(tài)觀察 挑選純化的單菌落做革蘭氏染色鏡檢。

2.1.4 生化確證試驗 挑取純化的單菌落，使用麥?zhǔn)媳葷醿x，調(diào)至適宜的菌濃，用生化鑒定試劑盒、生化鑒定管或微生物鑒定系統(tǒng)，按說明進行鑒定試驗。

2.1.5 PCR確證試驗 通過文獻檢索，確定糞腸球菌PCR反應(yīng)引物及反應(yīng)體系[19]，應(yīng)用在PCR確證試驗中。引物F5’-TGCCGCATGGCATAAGAG-3’；R5’-TGCATCACCTCGCGGTCTAG-3’。PCR反應(yīng)體系如表1所示。

PCR反應(yīng)程序設(shè)定如下：①預(yù)變性：95℃5 min；②變性：95℃45 s；③退火：48℃45 s；④延伸：72℃45 s；⑤保溫：4℃30 min。步驟②～④的循環(huán)數(shù)設(shè)為30。

表 1 PCR反應(yīng)體系Table 1 PCR reaction system

2.2 計數(shù)培養(yǎng)基的篩選通過大量文獻檢索、資料查閱和基層調(diào)研，發(fā)現(xiàn)糞腸球菌計數(shù)培養(yǎng)基主要為糞腸球菌培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、腸球菌顯色培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂。使用含有糞腸球菌的單一和混合型飼料微生態(tài)制劑對培養(yǎng)基進行系統(tǒng)篩選篩選專屬性強、易于觀察計數(shù)的糞腸球菌計數(shù)培養(yǎng)基。

2.3 方法適用性試驗通過檢測5個微生態(tài)生產(chǎn)企業(yè)的15個產(chǎn)品（包括單一型和混合型飼料微生態(tài)產(chǎn)品），對試驗建立的方法進行方法的適用性考察。

2.3.1 檢樣的制備及稀釋 以無菌操作稱取試樣25 g（mL），加入225 mL 0.85%滅菌生理鹽水的三角瓶中（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）。置振蕩器上，振蕩30 min。經(jīng)充分振搖后，制成1:10的均勻稀釋液。用滅菌吸管吸取1:10的均勻稀釋液1 mL，置于滅菌的9 mL 0.85%滅菌生理鹽水離心管中，密封，渦旋儀渦旋10 s，經(jīng)充分混勻后制成1:100的稀釋液。根據(jù)樣品含菌量，按上述稀釋次序遞次稀釋至適宜的稀釋倍數(shù)。

表2 四種培養(yǎng)基成分表Table 2Composition of four media

2.3.2 接種和培養(yǎng)采用涂布法。選擇2個或者3個適宜的稀釋度，用滅菌吸管分別吸取0.1 mL，接種到糞腸球菌瓊脂平皿上，每個濃度接種2個平皿，使用無菌的涂布棒盡可能小心快速地涂布接種于培養(yǎng)基表面，涂布棒不得接觸平皿邊緣。每個平皿用1支無菌涂布棒。涂布好的平皿蓋好后室溫中放置15 min，使接種物完全被培養(yǎng)基吸收為止。翻轉(zhuǎn)上述平皿置36±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48±1 h。

2.3.3 菌落計數(shù)及篩選 培養(yǎng)后，選取菌落數(shù)在30～300個之間的平板計數(shù)。若平板中有較大片狀菌落生長時不宜采用，若片狀菌落不到一半，而其余一半中菌落分布有很均勻，即可計算半個平板后乘以2以代表整個平皿的菌落數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 形態(tài)學(xué)結(jié)果 典型糞腸球菌菌落呈圓形，表面光滑、隆起，菌落呈黑色或淡黑色，直徑在0.5～2.0 mm。然后從中選出5個特征菌落進行確證試驗。

3.2 鏡檢結(jié)果糞腸球菌細(xì)胞應(yīng)為球形，可順鏈的方向延長，直徑0.5～1.0 μm，單個、大多數(shù)成雙或短鏈狀排列，革蘭氏染色陽性，無芽孢，通常不運動。

3.3 生化確證結(jié)果 依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》（第九版）、《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》、《分子克隆實驗指南》第三版進行生化鑒定。糞腸球菌的主要生化特性見表3。

3.4 PCR鑒定確證結(jié)果通過對糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC29212）、金黃色葡萄球菌（ATCC29213）等標(biāo)準(zhǔn)菌株進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示該組引物對糞腸球菌具有較好的特異性。PCR鑒定結(jié)果如圖1。對5份含有糞腸球菌的飼料微生態(tài)制劑進行了PCR擴增，擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示該組引物能夠很好的擴增出混合產(chǎn)品中的糞腸球菌，具有較好的專屬性。鑒定結(jié)果如圖2。

表 3 糞腸球菌的主要生化特性Table 3 Main biochemical characteristics of enterococcus faecalis

3.5 計數(shù)培養(yǎng)基的篩選標(biāo)準(zhǔn)糞腸球菌菌株在試驗所選的4種培養(yǎng)基上均生長良好，圖3為標(biāo)準(zhǔn)糞腸球菌菌株分別在哥倫比亞血瓊脂、腸球菌顯色培養(yǎng)基、糞腸球菌培養(yǎng)基及MRS培養(yǎng)基上的菌落特征。但由于哥倫比亞血瓊脂和腸球菌顯色培養(yǎng)基成本較高，在實際生產(chǎn)中并不適用。

圖 1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCR鑒定圖譜Fig.1 PCR identification map of standard strains

圖 2 5份含有糞腸球菌的飼料微生態(tài)制劑PCR鑒定圖譜Fig.2 PCR identification of five feed microecological preparations containing enterococcus faecalis

圖 3 標(biāo)準(zhǔn)糞腸球菌菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落特征Fig.3 Colony characteristics of enterococcus faecalis in different media

圖 4 混合型飼料添加劑中糞腸球菌在不同培養(yǎng)基上的菌落特征Fig.4 colony characteristics of enterococcus faecalis in different media in mixed feed additive

同時，對混合型飼料添加劑中糞腸球菌，也進行了培養(yǎng)試驗，圖4為含有枯草芽孢桿菌和糞腸球菌的飼料微生態(tài)制劑產(chǎn)品在哥倫比亞血瓊脂、腸球菌顯色培養(yǎng)基、糞腸球菌培養(yǎng)基及MRS培養(yǎng)基上的菌落特征。由圖4可見，混合型產(chǎn)品中的枯草芽孢桿菌和糞腸球菌在哥倫比亞血瓊脂和MRS培養(yǎng)基上生長良好，但枯草芽孢桿菌嚴(yán)重干擾了糞腸球菌的生長，不能實現(xiàn)糞腸球菌的計數(shù)。而腸球菌顯色培養(yǎng)基和糞腸球菌培養(yǎng)基抑制了枯草芽孢桿菌的生長，能夠?qū)崿F(xiàn)糞腸球菌的計數(shù)。

3.6 方法適用性考察用本試驗建立的檢測方法分別檢測不同企業(yè)不同產(chǎn)品，結(jié)果如表4所示，表明該方法具有較好的適用性，能夠滿足實際生產(chǎn)的需要。

表 4 方法比較Table 4Comparison of methods

4 討論

通過對糞腸球菌計數(shù)培養(yǎng)基進行系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，單一飼料添加劑在4種培養(yǎng)基上生長均良好。但MRS的pH值對糞腸球菌的生長影響較大，市售的MRS培養(yǎng)基pH值一般為6.2左右，實際操作中需要調(diào)節(jié)MRS的pH值為7.2左右。哥倫比亞血瓊脂配制較難，不易保存，有效期只有7 d，且成本較高。而混合型飼料添加劑中糞腸球菌在MRS培養(yǎng)基和哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上的分離效果不好，混合型飼料添加劑中的枯草芽孢桿菌對糞腸球菌的生長有抑制作用，導(dǎo)致糞腸球菌不生長或很少生長。盡管文獻報道通過MRS改良、調(diào)節(jié)pH和加入氯化鈣等可抑制枯草等生長，但培養(yǎng)條件苛刻，結(jié)果不穩(wěn)定。腸球菌顯色培養(yǎng)基雖然分離效果好，計數(shù)方便，但是和哥倫比亞血瓊脂一樣，價格貴，成本高，不易于企業(yè)節(jié)約成本，實際生產(chǎn)中并不適用。

目前，企業(yè)微生態(tài)制劑產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)起草中，未要求對所含益生菌進行生化或PCR鑒定，缺少輔助鑒定環(huán)節(jié)，導(dǎo)致微生態(tài)制劑產(chǎn)品中實際添加益生菌種類與產(chǎn)品標(biāo)簽不符偶有發(fā)生。同時，市售混合型微生態(tài)制劑產(chǎn)品添加的益生菌種類較多，篩選出能夠具有較高專屬性的分離計數(shù)培養(yǎng)基，是企業(yè)自身保證產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵手段。因而，企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)增加準(zhǔn)確的鑒定方法，選用專屬性較高的計數(shù)培養(yǎng)基，對于監(jiān)督產(chǎn)品生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量，維護市場秩序具有重要意義。

5 結(jié)論

通過對飼料微生態(tài)制劑中糞腸球菌含量檢測方法的研究，建立了飼料微生態(tài)制劑中糞腸球菌含量檢測方法，確定了生化鑒定和PCR鑒定方法，并篩選出糞腸球菌培養(yǎng)基作為檢測飼料微生態(tài)產(chǎn)品中糞腸球菌含量的計數(shù)培養(yǎng)基。通過市售的飼料產(chǎn)品驗證，此方法適用于單一型和混合型飼料微生態(tài)制劑中糞腸球菌的含量檢測。