熱休克蛋白70-hom基因+2437 T/C位點基因多態性與慢性心力衰竭患者預后的關系研究

張偉，宋小英，李蕓

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一類廣泛存在于哺乳動物體內的高度保守的熱應激蛋白，按照蛋白大小分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60及小分子HSP。近年來越來越多研究證實，HSP70可維持鈣離子動態平衡，減輕由鈣離子介導的心肌損傷［1-2］；此外，其還參與慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）病理生理過程，且與CHF患者病情嚴重程度及遠期預后有關［3-4］。HSP70-hom基因+2437 T/C位點屬于非同義突變，該位點突變可直接影響HSP70結構、穩定性并與多種疾病有關［5-6］。本研究旨在探討HSP70-hom基因+2437 T/C位點基因多態性與CHF患者預后的關系，為改善CHF患者預后提供參考依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2013年1月—2015年7月延安大學附屬醫院東關分院心內科收治的CHF患者366例，年齡18～80歲，均符合中華醫學會心血管病學分會制定的《中國心力衰竭診斷和治療指南2014》［7］中的CHF診斷標準；并排除合并心臟瓣膜病、先天性心臟病、心包疾病、心肌炎等其他類型心臟病者，合并嚴重肝腎疾病、惡性腫瘤、內分泌系統疾病、血液系統疾病、風濕免疫系統疾病、感染性疾病者，妊娠期婦女。按照隨訪結果將所有患者分為預后不良組90例和預后良好組276例。本研究經延安大學附屬醫院東關分院倫理委員會審核批準，所有患者及其家屬知情并簽署知情同意書。

1.2 觀察指標

1.2.1 臨床特征 分析所有患者臨床特征，包括年齡、性別、體質指數、有無冠心病、有無高血壓、有無糖尿病、吸煙（吸煙≥1支/d且至少吸煙3個月者定義為吸煙）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）、紐約心臟病協會（NYHA）分級。所有患者入院后采用Philips公司生產的Elite型多普勒彩色超聲心動圖檢測左心室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、右心室舒張末期內徑（right ventricular end diastolic diameter，RVEDD）及左心室射血分數（1eft ventrieular ejection fraction，LVEF）。

1.2.2 血清HSP70水平 采集所有患者清晨空腹外周靜脈血并置于肝素抗凝的無菌聚丙烯試管中，3 000 r/min離心5 min（離心半徑13.5 cm），留取上清液并置于-20 ℃冰箱中保存待測，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清HSP70水平，試劑盒購自美國R&D公司，并嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 基因多態性 基因多態性檢測方法如下：（1）DNA提?。翰杉颊咔宄靠崭雇庵莒o脈血，采用DNA提取試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司生產〕提取全血基因組DNA；（2）聚合酶鏈式反應（PCR）擴增：PCR反應體系主要包括上游引物（上游引物序列：5′-GGACAAGTCTGAGAAGGTACAG-3′）和下游引物（下游引物序列：5′-GTAACTTAGATTCAGGTCTGG-3′）各 1 μl、dNTP混合物 2 μl、Taq DNA聚合酶0.25 μl、模板 DNA 1 μl、10×Buffer 2.5 μl。反應條件：95 ℃預變性4 min，然后按照變性95 ℃ 20 s、退火60 ℃ 30 s、延長72 ℃ 50 s的順序循環30個周期，最后72 ℃延長3 min；（3）酶切：取0.5 μl延伸產物，采用限制性內切酶NcoⅠ進行酶切，酶切體系包括 PCR 產物 17 μl、10×Buffer 2 μl、內切酶 1 μl，反應條件為37 ℃ 16 h，然后于65 ℃下酶切10 min終止反應；（4）基因型判讀：取酶切產物進行電泳，其中僅有1條878 bp電泳帶為C/C基因型，有2條長度分別為327、551 bp電泳帶為T/T基因型，有3條長度分別為327、551、878 bp電泳帶為T/C基因型，HSP70-hom基因+2437 T/C位點聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）電泳圖見圖1。

1.3 隨訪 所有患者出院后1個月內門診隨訪1次，之后每3個月門診或電話隨訪1次，至少隨訪2年。記錄所有患者隨訪期間心血管事件發生情況，包括心源性死亡（心源性猝死及充血性心力衰竭導致的死亡）、心臟移植、惡性心律失常及CHF再住院。本研究將隨訪期間發生心血管事件定義為預后不良，未發生心血管事件定義為預后良好。

圖1 HSP70-hom基因+2437 T/C位點PCR-RFLP電泳圖Figure 1 PCR-RFLP electrophoresis for HSP70-hom gene +2437 T/C locus

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據處理，符合正態分布的計量資料以（x ±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（QR）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗；計數資料分析采用χ2檢驗；Hardy-Weinberg平衡定律采用吻合度檢驗；CHF患者預后影響因素分析采用多因素Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡 本組患者中T/T基因型者236例（占64.5%）、T/C基因型者115例（占31.4%）、C/C基因型者15例（占4.1%），基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（χ2=0.044，P＞0.05）。

2.2 不同基因型患者血清HSP70水平比較 T/T基因型患者血清HSP70水平為12.4（3.6）μg/L，T/C基因型患者為12.3（3.4）μg/L，C/C基因型患者為11.0（3.1）μg/L；不同基因型患者血清HSP70水平比較，差異無統計學意義（u=1.329，P＞0.05）。

2.3 不同預后患者臨床特征比較 預后良好組和預后不良組患者男性比例、體質指數、冠心病發生率、高血壓發生率、糖尿病發生率、吸煙率、TG、LDL-C比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；預后不良組患者年齡大于預后良好組，BNP、NYHA分級Ⅲ～Ⅳ級者所占比例及LVEF高于預后良好組，LVEDD、RVEDD長于預后良好組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.4 不同預后患者基因型及等位基因比較 預后良好組和預后不良組患者基因型比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；而等位基因分布頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表2）。

2.5 CHF患者預后影響因素分析 將表1～2中有統計學差異的指標作為自變量，將預后作為因變量（變量賦值見表3）進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，BNP、RVEDD、LVEF及基因型是CHF患者預后的獨立影響因素（P＜0.05，見表4）。

表1 不同預后患者臨床特征比較Table 1 Comparison of clinical features in patients with different prognosis

表2 不同預后患者基因型和等位基因分布頻率比較〔n（%）〕Table 2 Comparison of genotypes and allelic frequency in patients with different prognosis

表3 變量賦值Table 3 Variable assignment

表4 CHF患者預后影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis on influencing factors of prognosis in patients with CHF

3 討論

HSP家族最重要的生物學功能是在各種應激狀態下維持細胞自身穩定，故被認為是細胞損傷的保護因素。近年來不斷有研究發現，多個HSP家族成員均參與了CHF的發生發展過程，其中HSP70關注較多［3-4，8］。既往有研究顯示，急性心力衰竭（acute heart failure，AHF）患者血清HSP70水平明顯升高，分析原因可能與壞死的心肌細胞釋放大量HSP70入血及機體啟動應激保護機制有關［9］；而CHF患者血清HSP70水平明顯降低，分析原因可能為心力衰竭患者心肌細胞功能減退，長期慢性炎性反應可抑制HSP70表達，且血清HSP70水平與年齡、CHF病程呈負相關［3］。但也有研究結果顯示，HSP70水平與CHF嚴重程度呈正相關，病情越重則HSP70水平越高［10］。筆者分析研究結果產生不同的原因可能與納入的CHF患者病程長短有關，病程短者HSP70水平趨近于AHF患者。

人類HSP70基因位于6p21.3，是一種高度保守基因，由HSP70-1、HSP70-2、HSP-hom組成。HSP70-hom基因+2437 T/C位點是目前研究最多的單核苷酸多態性位點之一，該位點的T→C突變是一種非同義突變，可將HSP70肽鏈中的一個蛋氨酸替換為蘇氨酸，進而直接影響HSP70的結構及穩定性［5-6］。本研究結果顯示，本組患者基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，具有群體代表性；且不同基因型患者血清HSP70水平間無差異，提示HSP70-hom基因+2437 T/C位點基因多態性發揮生物學功能與HSP70水平無關，可能與HSP70蛋白自身結構及穩定性有關；但本研究中C/C基因型患者例數較少，故不能排除檢驗效能不足。

另外，不同地區、不同種族人群基因型和等位基因分布頻率間具有明顯差異。既往有關西方人群HSP70-hom基因+2437 T/C位點基因多態性的研究顯示，突變純合子基因型頻率為5%～20%［11-12］；而我國漢族健康人群突變純合子基因型頻率為1%～5%［5-6，13-14］，本研究結果與之相一致。近年來國內外研究相繼發現，HSP70-hom基因+2437 T/C位點基因多態性與腦梗死、冠心病及多種腫瘤發生有關［5-6，13，15］。本研究旨在探討HSP70-hom基因+2437 T/C位點基因多態性與CHF患者預后的關系，結果顯示，BNP、RVEDD、LVEF及基因型是CHF患者預后的獨立影響因素。

綜上所述，HSP70-hom基因+2437 T/C位點基因多態性與CHF患者預后有關，C/C基因型可能增加CHF患者預后不良發生風險。但本研究為單中心研究，樣本量較小，且C/C基因型患者例數較少，故研究結果存在一定偏倚，仍需進一步研究證實。

作者貢獻：張偉進行文章的構思與設計、研究的實施與可行性分析，數據收集、整理、分析，負責撰寫論文；宋小英進行文章的質量控制及審校；李蕓負責結果分析與解釋，并對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。