結核感染T細胞斑點試驗在結核性胸膜炎診斷中的價值

趙忠勤

（遼寧省撫順市第四醫院結核二病房，遼寧 撫順 113123）

結核性胸膜炎是一種肺外結核病，在我國被列為結核病的第四類型，是引起患者胸腔積液的主要原因，占比可達49.5%～54.5%[1]。結核性胸膜炎沒有特異性的臨床表現，增大了診斷的難度。目前在為結核性胸膜炎患者實施很短的過程中，最為主要的診斷參考依據有：胸腔積液的常規檢查、影像學表現、臨床表現、病史問詢等，并要結合臨床治療效果實施判斷，通過這種常規的診斷方式，其診斷準確率是比較低的，難以將其與惡性胸腔積液予以良好的鑒別，很容易導致出現誤診，從而引發嚴重后果。隨著各項技術的進步與發展，在結核性胸膜炎的臨床診斷工作中，逐漸引進了病理學檢查與細菌學檢查，隨著一段時間的研究與發展，這意見逐漸發展成為結核性胸膜炎診斷的金標準，但是在實際的臨床應用中，結核性胸腔積液當中所包含的細菌含量是比較小的，胸腔積液中結核菌培養及涂片分枝桿菌陽性率是比較低的，再加上胸腔積液中結核分枝桿菌的培養時間比較長，通過胸腔鏡取病理檢查或者是胸膜活檢的方式檢查出的陽性率是比較高的，但是這都是有創的檢查方式，很難在臨床上大規模的常規應用。隨著分子生物學技術及免疫學技術的進一步發展，其在大規模篩查中的適用性越來越高，并且具有快速、簡便的特點，但是還是存在操作不當影響檢查結果、假陽性等缺陷，這導致其在結核性胸膜炎診斷中的應用存在一定的局限性，探究一種新型的檢測技術，促使結核性胸膜炎診斷準確性的提升具有非常重要的意義。為了提高診斷的準確率，以本院2015年11月～2017年11月收治的55例結核性胸膜炎的患者為研究對象，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對象選為2015年11月～2017年11月于本院接受診治的結核性胸膜炎患者、惡性胸腔積液患者、非結核性胸膜炎患者和健康志愿者各55例，所選患者均無合并其他嚴重的器官性疾病和精神疾病等。結核性胸膜炎組有男28例和女27例，年齡20～70歲，平均（42.8±13.5）歲；惡性胸腔積液組有男29例和女26例，年齡24～68歲，平均（43.5±11.8）歲；非結核性胸膜炎組有男27例和女28例，年齡22～69歲，平均（43.0±11.4）歲；健康志愿者組有男28例和女27例，年齡22～70歲，平均（43.7±11.2）歲。對4組患者的臨床資料進行比較差異無統計學意義，具有可比性。1.2 方法 采集被檢者的外周靜脈血4 ml，放置于抗凝試管中，加入一定量的肝素鋰并使其混合均勻，在4小時內完成外周血單個核細胞（PBMC）的分離，具體操作如下：取一個離心管，記為1號，注入4 ml RPMI1640培養液，將混合均勻的4 ml抗凝血液樣本導入此離心管中，使二者均勻混合。再取一個離心管，記為2號，注入淋巴細胞分離液3 ml，將先前完成混合的血壓樣本緩慢倒入2號離心管中淋巴細胞分離液的上方，然后置于離心機中進行離心操作，時間設置在20 min左右，離心完成后用加樣器吸取白細胞層，放入一個15 ml的離心管中，記為3號，再加入RPMI1640培養液11 ml，離心7 min，待沉淀完全后取分離出的上清液于離心管4號，加入一定量的無血清培養液，即AIMV，配置細胞工作液。

以細胞工作液進行結核感染T細胞斑點試驗：在板條上制4孔，分別加入50μl的AIMV、抗原A（ESAT-6：結核分枝桿菌早期分泌靶向抗原6）、抗原B（CFP-10：培養濾液蛋白10）和陽性對照[2]，在每個孔中均加入100μl的細胞工作液。將板條放置入CO2培養箱中進行16～20 h的溫育，箱內溫度維持在37℃，CO2濃度為5%。溫育時間到達后，取出板條，倒出孔中液體，使用磷酸鹽緩沖液沖洗4次后，于每孔加入堿性磷酸酶標記過的小鼠抗人IFN-γ單克隆抗體50μl，再次置于CO2培養箱中進行1 h的溫育，箱內溫度設定在4～8℃，板條取出后再次用磷酸鹽緩沖液沖洗4次。沖洗過后，加入50μl的顯色底物，置于培養箱中在暗處、室溫下溫育7 min，取出板條后用自來水沖洗，晾干，2～3 h后讀取結果。

1.3 觀察指標 比較4組被檢者的陽性率，以T-SPOT.TB試劑盒的使用說明書為所測血液樣本結果的判定依據，陽性：血液樣本的陰性對照孔斑點形成細胞（SFC）小于6，且（檢測孔SFC-陰性對照孔SFC）×4的計算值不小于24；陰性：血液樣本的陰性對照孔SFC不小于6，且檢測孔SFC為陰性對照孔SFC的2倍。

1.4 統計學方法 本研究數據均用SPSS 19.0統計軟件處理，計數資料用例數（n）表示，計數資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

以ESAT-6抗原、CFP-10抗原作為刺激物時，結核性胸膜炎組的陽性率大幅超出惡性胸腔積液組、非結核性胸膜炎組和健康志愿者，組間比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。ESAT-6/CFP-10聯合2種抗原檢測的陽性率顯著高于單種抗原檢測的陽性率，對比差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 4組被檢者的測試結果統計情況[n（%）]Table 1 4 Statistics of test results for 4 groups of subjects[n(%)]

3 討論

胸膜炎是致病因子侵犯人體的胸膜引起炎癥的疾病，可分為10種類型，結核性胸膜炎是最為常見的一種，是結核桿菌及其自溶產物、代謝產物進入機體的胸膜腔而引發的[3-4]。結核性胸膜炎患者的臨床表現不存在特異性，難以根據臨床癥狀來確診。臨床上將在胸腔積液中檢查到抗酸桿菌和結核分枝桿菌培養陽性作為診斷的金標準，如果利用細菌學方法診斷，檢測的陽性率很低；胸膜活檢的準確性高，但是對患者的創傷很大[5-6]。因此，臨床上需要一種無創微創、檢測陽性率高的方式來進行早期診斷。

本研究中使用的結核感染T細胞斑點試驗是在酶聯免疫斑點技術的基礎上發展而來的，檢測原理是基于結核分枝桿菌的基因中存在著“RD1”的序列，該序列編碼能產生兩種蛋白，分別是本研究中使用的ESAT-6和CFP-10，以這兩種蛋白作為特異性抗原，能將機體中的T淋巴細胞刺激成為致敏T淋巴細胞，并分泌出IFN-γ細胞因子[7-8]；結核感染T細胞斑點試驗能夠從單細胞水平檢測到分泌抗體細胞或者是分泌細胞因子細胞，每個顯色斑點均代表著一個結核分枝桿菌致敏的T淋巴細胞，因此，通過斑點的數目即可判定機體內是否存在著致敏T淋巴細胞，并可計算數目，從而可知是否存在著結核分枝桿菌[9]。從研究結果來看，結核性胸膜炎組結核感染T細胞斑點試驗的陽性檢出率高達85.5%和78.2%，聯合使用ESAT-6和CFP-10的話，可將陽性率大幅提高至92.7%。已有的研究結果指出，效應T淋巴細胞的存活期是非常短的，一般在病原體被消滅之后就會消失，所以臨床上對外周血結核感染T細胞斑點試驗結果來進行評估，也能夠對患者的臨床療效評估及病情活動性的監測提供一定的參考依據。結核感染T細胞斑點試驗出現假陰性或者是假陽性的概率也是非常低的，出現假陰性可能與在細胞免疫發生前獲取了標本存在一定的關聯性，有時也會因為少數免疫系統功能的不健全導致其值與臨界值接近，對于這種情況，對所選取的參考值應仔細考量、慎重選擇，綜合的考慮其他輔助檢查結果及患者的臨床表現來進行進一步的判斷，對于假陽性的出現，可能與患者曾今有過結核分枝桿菌潛伏性感染存在一定的關聯性[10]。與傳統的酶聯免疫法相比，結核感染T細胞斑點試驗應用于結核性胸膜炎患者臨床診斷中的穩定性更高，但是實驗人員操作手法等外在因素也會對試驗結果產生影響，并且在溫度環境比較低的情況下，環境中的效應T淋巴數量會有所減少，若是將獲取的胸水長時間放置，會導致其T淋巴數量逐漸減少，甚至是消失，因此，臨床診斷過程中，送檢的胸水必須是新鮮采集的。

綜上所述，核感染T細胞斑點試驗用于結核性胸膜炎的診斷有較高的準確率，操作簡單，建議臨床采納和推廣。