基于液相色譜-質譜聯用的血清代謝組學在中醫上火研究中的應用

吳德鴻周佳李倩倩譚祖教范永升

1.浙江中醫藥大學附屬第二醫院 杭州 310005 2.浙江中醫藥大學基礎醫學院

“上火”的概念源于中醫學對人體和疾病的認識，但中醫學中尚無專門論述，其內容散見于中醫火熱病證中。上火的基本病機為陰陽失衡，火熱上炎于頭面，其臨床表現主要以口舌生瘡、口腔潰瘍、牙齦及咽喉腫痛、眼睛紅腫等頭面部癥狀為主，也常兼見心煩易怒、小便色黃、大便秘結等熱證表現，屬中醫學“火熱”證的范疇。

現代醫學至今還未有與上火相對應的病名，一般認為上火與機體免疫功能失調情況下出現的局部感染或炎癥反應相類似，同時認為上火是機體受到外界應激負荷后在生理和心理上產生的一種不協調的應激反應，是機體失去內環境穩定而出現的身心疲勞狀態，其發生可能與機體的神經-內分泌-免疫網絡失衡相關。隨著亞健康觀念的提出以及人們對健康追求的逐步重視，在祖國醫學對上火認識的基礎上，運用現代的科學技術方法，開展上火的病理機制研究，不僅能夠豐富其內涵，同時對于上火的防治也有著重要的現實意義。

代謝組學以病理生理等刺激下機體內源性代謝物發生的相應變化為研究對象，可以從整體上反映機體在疾病發生發展過程的代謝狀態改變，有助于闡明病變過程，為疾病預防、診斷提供有用信息。目前代謝組學被廣泛用于疾病診斷、藥物安全性評價、發病機制探討、藥物作用機制研究等醫藥相關領域[1-3]。液相色譜-質譜聯用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技術具有分離能力強、檢測靈敏度高、分析通量高、檢測范圍廣等優點，在代謝組學研究中應用非常廣泛。

本研究以在校學生及教師為研究對象，采用LCMS技術對上火和非上火人群血清中代謝物進行檢測，并結合多變量和單變量統計挖掘出上火后發生顯著變化的血清代謝物，進一步進行結構鑒定，以期從代謝角度為上火機制的深入研究提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 主要儀器 LC 1260/Q-TOF 6520液相色譜-質譜聯用儀為美國Agilent公司產品；Labconco CentriVap System冷凍離心濃縮儀為美國Labconco公司產品；超純水由Milli-Q系統（美國Millipore公司產品）制備。

1.2 試劑 色譜純乙腈購于Sigma公司（批號：SHBB8059V）。

1.3 實驗方法

1.3.1 上火的診斷標準 采用專家咨詢法，通過多輪專家咨詢，確定了上火的診斷標準：1個主證（頭面部癥狀）或2個次證（至少1個為頭面部癥狀）。其中上火頭面部主證：牙齦腫痛、咽喉腫痛、口臭、口腔潰瘍、鼻瘡癤、熱瘡（顏面部皰疹）、口苦、目赤干澀；上火頭面部次證：口角糜爛、目眵增多、舌痛、口渴、鼻衄、鼻腔干燥、齒衄、痤瘡、聲音嘶啞、頭痛；非頭面部癥狀：大便干結、心煩、小便黃、多食易饑、五心煩熱、痔瘡發作、潮熱、失眠。

1.3.2 樣本的收集和前處理 選取2013年3月至5月浙江中醫藥大學在校學生及教師54例，年齡22～3 6歲，無重大疾病，排除妊娠、哺乳期婦女和其他不適宜入選的情況。其中符合納入標準的上火病例30例，年齡（22.0±1.3）歲；作為對照組的非上火人群24例，年齡（23.1±3.1）歲。兩組受試者年齡無統計學差異（P＞0.05）。受試者填寫調查表，空腹狀態下以促凝管采集血5mL，2 000r/min離心分離血清，-80℃保存。

分析前，血清于室溫下解凍并混勻，取100μL血清，加入4倍體積冷乙腈，渦旋后4℃下12 000r/min離心10min沉淀蛋白，取上清液用于分析。同時，所有血清樣本分別取20μL，混勻后按照上述方法進行相同前處理，制備質量控制（quality control，QC）樣本。

1.3.3 代謝數據采集 以LC-MS作為分離檢測平臺，研究上火人群的血清代謝特征，在質譜正離子模式下采集數據。色譜條件為：ZORBAX SB-Aq C18柱（2.1mm×50mm×1.8μm，Agilent）用于色譜分析，進樣量5μL，柱溫保持在30℃。流動相A為0.1%甲酸/水，流動相B為0.1%甲酸/乙腈。流速為0.3mL/min，洗脫梯度為：20%B 起始，0～8min 線性升至 50%B，8～12min線性升至 55%B，12～18min線性升至 75%B，18～20min線性升至98%B，在98%B保持2min，然后降至20%B并保持6min以平衡色譜柱。

質譜條件為：電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI），采用正離子模式檢測，使用高純N2輔助噴霧電離與脫溶劑，干燥氣溫度350℃，流速為9L/min，霧化氣壓40psi；離子源溫度350℃，毛細管電壓為4 000V，溶劑化離子去簇電壓175V，錐孔電壓65V，Centroid模式采集質譜數據，每0.50s采集1次；質量掃描范圍m/z 50～1 000。分析過程中采用參比溶液對質量軸進行同步實時校正。靶標二級質譜分析用來輔助鑒定代謝物，碰撞能量為10、20、40eV。

1.3.4 數據分析 通過安捷倫MassHunter定性分析軟件（美國Agilent公司產品）進行分子特征提?。╩olecuar features extraction algorithm，MFE），實現對譜圖中代謝特征的識別，包括濾噪和同位素峰合并。提取參數：保留時間為 0.6～22min，質荷比為 50～1 000m/z，信號閾值為100counts，化合物閾值為2 000counts。將MFE后生成的CEF文件導入到Mass Profiler Professional軟件（美國Agilent公司產品）進行色譜與質譜匹配。色譜匹配時使用默認設置，質譜匹配窗口值為20mDa+50ppm。匹配完成后形成包含保留時間、質量數、響應值信息的峰表。QC樣本中相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）大于30%的變量被刪除，以保證數據的可靠性，另外，對于超過30%樣品中響應值為“0”的離子采取過濾處理以減小缺失值的影響。

多元統計分析在SIMCA-P 11.0軟件（瑞典Umetrics Corp公司產品）中完成。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交信號校正-偏最小二乘判別分析（orthogonal signal correction-partial least squares discriminant analysis，OSC-PLS DA）對上火和非上火血清樣本進行分型，篩選變量重要性因子（variable importance in the projection，VIP）＞1 的變量進行后續的t檢驗，t檢驗在SPSS 16.0統計軟件中完成。VIP＞1且在兩組內有統計學差異的變量（P＜0.05）對兩組樣品的區分起了重要作用，之后對這些差異代謝物進行靶標二級質譜分析以鑒定其結構。

2 結果

2.1 分析方法考察 儀器分析過程中將QC樣本均勻地插入分析序列中用于監控整個樣品分析過程中的儀器狀態波動情況，以確保數據的可靠性，每分析10個樣本插入1個QC，樣品分析順序完全隨機以減少系統誤差。圖1為典型的LC-MS代謝指紋譜。

圖1 典型的血清HPLC-MS代謝指紋譜Fig.1 Representative serum metabolic profile analyzed by LC-MS

在7個QC樣本中代謝物響應值的RSD分布趨勢見圖2A。在所有QC樣本中超過78.01%的變量響應值RSD＜30%。刪除QC中RSD＞30%的變量，同時排除樣品中出現頻率＜70%的變量，最終保留了521個變量的信息，對代謝數據進行單位方差標度化轉換，即每個變量除以該變量方差的平方根，從而在一定程度上消除了響應差異的影響又不至于放大系統偏差。在PCA分析中，QC樣本緊密地聚集在PCA得分圖的幾何中心附近，表明分析過程中代謝物分析的質量控制良好,得到的代謝數據可靠。見圖2B。

2.2 上火與非上火人群的模式識別分析 采用非監督的PCA對兩組樣本的整體代謝輪廓進行分析，上火和非上火人群在PCA二維得分圖上無明顯分離（圖2B），這可能與飲食和環境等因素造成的樣本不均一性有關；為了更好地建立模型及提高模型預測能力，進一步對數據進行正交信號校正（orthogonal signal correction，OSC），濾除與分類無關的信息（飲食、環境等影響）之后進行PLS DA建模。圖3A顯示兩組人群得到了很好的分離，表明上火后代謝表型出現一定的變化。模型參數良好，R2Y（cum）=0.992，Q2（cum）=0.960。圖3B是OSC-PLS DA 第一主成分V圖。以代謝物在上火人群與非上火人群的濃度比值取log2對數為橫坐標，t檢驗P值取-log10對數為縱坐標，繪制代謝物火山圖?；鹕綀D顯示LC-MS檢測到的血清代謝物中，上火后55個發生顯著變化，且大部分濃度發生下調。見圖3C。

圖2 代謝物RSD分布情況和PCA分析得分圖Fig.2 The RSD distribution plot of QC samples and PCA score plot

圖3 上火與非上火人群的代謝差異分析Fig.3 Metabolic difference between Shanghuo patient and control groups

2.3 上火人群血清差異代謝物 結合火山圖和VIP值篩選出上火與非上火人群存在顯著差異的代謝物，部分差異代謝物結構已經確認，主要是脂類物質，包括2種磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、2種溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）、1 種磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、1種溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine，LPE）、2種鞘脂（sphingolipid，SM）、1種甘油三酯（triglyceride，TAG）及膽紅素（bilirubin）等，上述代謝物在上火后下調明顯（P＜0.05）。見圖 4。

3 討論

上火是民間的一種俗稱，概念形成于祖國醫學對其癥狀和病因病機的樸素認識。中醫學著述中未對上火進行專門論述，但其癥狀表現與中醫學中的“牙宣”“口瘡”“唇風”“目赤”等相類似。上火發病部位多位于人體的頭面之上，因此，從發病部位而言，上火具有“在上之火”的含義，符合“火熱上炎”的特性，其是由多種原因引起陰陽失調、火熱偏盛而導致的一系列以頭面部為主的癥狀，其臨床表現主要為口舌生瘡、口腔潰瘍、口眼干燥、牙齦及咽喉腫痛、眼睛紅腫、痤瘡等，同時也常兼見心煩易怒、小便色黃、大便秘結等火熱證表現?，F代醫學對上火的研究較少，認為上火與多種因素引起的神經-內分泌-免疫網絡失衡以及能量代謝相關聯，但也有少量的實驗研究成果，如陳娟等[4]發現實熱上火人群體內多種蛋白表達發生異常，如載脂蛋白C3、乳酸脫氫酶等上調，載脂蛋白A4、超氧化物歧化酶3、纖溶酶原激活物抑制劑1等下調。筆者前期研究也發現，實熱上火人群體內三羧酸循環、脂肪酸代謝、氨基酸代謝發生特異性變化[5]。

代謝組學運用現代化的儀器設備和分析技術檢測機體整個代謝產物譜的變化，并通過多元統計分析方法研究整體的生物學功能狀況，與中醫的整體觀相吻合。基于LC-MS技術的代謝組學平臺分析范圍廣、靈敏度高，因而可全面地表征上火人群血清代謝組的特異性變化，為進一步探索上火的發病機制提供參考依據。本研究采用LC-MS技術檢測上火人群和非上火人群的血清代謝物后發現，上火人群與非上火人群的代謝譜存在顯著差異，部分差異代謝物結構已經確認，主要是脂類物質，如 PC（34:1）、PC（38:7）、LPC（18:1）、LPC（16:0）、LPE（18:2）、PE（34:2）、SM（44:2）、SM（40:2）、TAG（53:3）及膽紅素等，以上代謝物在上火人群中明顯低于非上火人群。

從上述結果可見，上火人群血清異常代謝物主要是脂類物質和膽紅素等。有文獻報道脂與類脂成分改變可作為細胞老化的標志，脂質過氧化對細胞有損害作用并與細胞老化有關[6]?；钚匝踝杂苫╮eactive oxygen species，ROS）是造成衰老的主要因素，細胞膜上含不飽和脂肪酸側鏈的磷脂是天然的抗氧化物質，可與ROS反應，使之被清除，而反應生成的過氧化脂質會破壞細胞膜的結構和功能。研究證實，許多衰老有關的疾病如動脈硬化癥、高血壓、阿爾茲海默癥以及帕金森病等的發生發展與脂質的異常變化有關[7-9]。本研究發現上火人群體內多種含不飽和脂肪酸鏈的磷脂水平明顯下降，這可能與上火后氧化應激水平的升高有關。林富祥等[10]采用大學生“上火”調查問卷的形式對1 051名在校大學生進行流行病學問卷調查，結果發現經常熬夜、壓力過大以及辛辣食物是引發上火的主要原因，而這些因素也是加速人體衰老的原因，可見上火與衰老是有相關性的。摒棄不良的生活習慣、緩解工作和生活壓力不僅可以預防上火，還可減緩人體的衰老。

圖4 差異代謝物在上火和非上火人群中的變化Fig.4 Significant differential metabolites between Shanghuo patient and control group

血清膽紅素是血紅素代謝的終產物，以往僅用于臨床肝膽疾病的診斷。自1987年發現膽紅素有抗氧化作用以來，有關膽紅素的研究越來越受到關注。研究發現膽紅素是生理性的抗氧化劑，它不僅能抑制脂質氧化及ROS的形成，還能抑制免疫反應及炎癥反應[11-12]。因此，筆者推測上火主要表現為口腔潰瘍、口瘡等一些頭面部的炎癥反應，這與膽紅素的含量減少不能有效抑制免疫反應及炎癥反應相關。

上火的發生是一個復雜過程，涉及到免疫、內分泌、神經、代謝等多個系統，本研究運用代謝組學中的LC-MS技術從整體上檢測上火人群血清代謝物的變化，發現血清中多種脂類物質和膽紅素水平均有一定程度下調，可能與上火人群體內炎癥反應加強、氧化應激水平升高有關。下一步將運用這些最下游的血清代謝物來回溯其上游相關信號通路中蛋白、基因的表達，以更好地闡述上火的病理機制，這也是筆者運用代謝組學研究上火的重要目標。