從AMPK能量調節功能探討紅參上火機制

浙江中醫藥大學 杭州 310053

上火是指因精神緊張、過度勞累、進食辛熱藥物和食物、氣候變化等因素引起的、以頭面部口、舌、牙齦、咽喉、鼻、眼等部位皮膚黏膜出現紅腫熱痛、潰瘍為主，并可伴有全身癥狀的一種輕微且易反復的綜合征。臨床觀察發現，不當進補紅參湯或飲用紅參酒后會發生上火[1]，而紅參引起上火的病理生理機制目前尚無系統的文獻報道。課題組前期研究發現，上火的發生伴有能量代謝的紊亂。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK）是真核細胞生物中廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，被稱為“細胞能量檢測器”，能感知細胞能量代謝狀態的改變[2]。研究發現，紅參及其有效成分人參皂苷具有活化AMPK的作用，在代謝相關性疾病中發揮作用[3-4]。因此，本實驗以AMPK能量調節功能為核心，通過檢測紅參上火模型大鼠的能量代謝變化，探索紅參上火的相關機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級雌性Wistar大鼠40只，6周齡，體質量（160±20）g。購買于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司 [實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2013-0016]，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2018-0012]。所有大鼠受試前籠養7d適應環境。全封閉清潔級狀態下隔離飼養，室溫20℃，相對濕度40%～60%，光照12h/d，自由攝食和飲水。

1.2 主要藥物和試劑 正官莊牌高麗紅參飲片450g（產地：韓國，批號：JY20150235），采購自浙江英特醫藥藥材有限公司，并由該公司出具上海市食品藥品檢驗所提供的檢驗報告書，檢驗結果符合進口藥材質量標準及2015年中國藥典標準。BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司（批號：P0012）；抗AMPK抗體、抗增殖物受體γ共激活因子-1α（peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α） 抗體、抗核呼吸因子 1（nuclear respiratory factor 1，NRF1）抗體購于英國Abcam公司（批號：ab32047、ab4481、ab175932）；大鼠血清促甲狀腺素（thyroid stimulating hormone，TSH）、17-羥皮質類固醇（17-hydroxycorticosteroid，17-OHCS）ELISA檢測試劑盒購于上海源葉生物科技有限公司（批號：YY02114B、YY02077B）；RNAiso Plus為日本 Takara公司產品（批號：9108）；超微量Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶檢測試劑盒、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase,SDH）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所（批號：A016-2、A022）。

1.3 儀器 冷凍混合球磨儀購于弗爾德（上海）儀器設備有限公司；凝膠玻璃板、固定架、垂直電泳儀、轉印系統、凝膠圖像分析系統均為美國Bio-Rad公司產品；臺式低溫高速離心機、微量移液器購于德國Eppendorf公司；熒光定量PCR儀為瑞士羅氏公司產品；多功能酶標儀購于美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 方法

1.4.1 紅參水煎劑的制備 高麗紅參飲片450g，加10倍單蒸水浸泡30min，加熱煮沸，文火煎煮1.5h，趁熱濾過。按同法再煎煮1次，合并2次濾液，用旋轉蒸發器濃縮提取液。

1.4.2 上火動物模型制備 參照常用實驗動物及人的體表面積比例乘以系數0.018，將紅參臨床劑量換算成大鼠的每日用量0.54g，根據大鼠每日灌胃2mL的用量計算出用藥濃度。將大鼠隨機分為4組，紅參高劑量組（藥物濃度0.54g·mL-1）、紅參中劑量組（藥物濃度0.27g·mL-1）、紅參低劑量組（藥物濃度0.135 g·mL-1）和正常對照組，每組各10只。紅參高、中、低劑量組分別以相應劑量紅參水煎劑2mL灌胃，1次/d，共15d，建立實熱上火大鼠模型；正常對照組以0.9%氯化鈉溶液2mL灌胃，1次/d，共15d。灌胃第14天所有大鼠上代謝籠，稱量并計算出大鼠上代謝籠前以及下代謝籠后24h的飲食量、飲水量、糞便量及尿量。所有實驗大鼠在末次灌胃2h后麻醉，開腹后腹主動脈取血，并完整剝離肝臟。

1.4.3 ELISA法檢測TSH、17-OHCS的含量 用蒸餾水按1:20稀釋20×洗滌緩沖液。以洗滌緩沖液洗板5次，從室溫平衡20 min的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃；設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；樣本孔先加待測血漿樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。棄去液體，以洗滌液重復洗板5次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。每孔加入終止液50μL，15min內于450nm波長處測定各孔的OD值。繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

1.4.4 Western blot檢測 AMPK、PGC-1α、NRF1蛋白表達水平 提取肝臟組織蛋白，并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取20～40μg肝臟組織蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，在冰水浴中轉膜2h。轉膜后將PVDF膜置于1%BSA的封閉液中，放于水平搖床上，室溫封閉1.5h，4℃下一抗孵育過夜。回收一抗溶液，TBST洗膜3次，將膜放于1:10 000稀釋的IRDy680或者IRDy880標記的二抗中，避光室溫孵育2h。TBST洗膜3次，再將PVDF膜置于Bio-Rad凝膠成像儀中進行掃描，掃描后以Quantity One軟件對圖像進行光密度值分析。

1.4.5 Real-time PCR 檢測 AMPK、PGC-1α、NRF1 mRNA表達水平 提取肝臟組織總RNA，用One Drop儀器測定總RNA濃度。將RNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄條件為37℃ 15min（逆轉錄反應），85℃5s（逆轉錄酶失活反應），穩定到4℃。逆轉錄結束，-20℃保存。cDNA擴增反應條件如下：預變性95℃30s；PCR 反應 95℃ 5s，50℃ 30s，72℃ 45s，共 45 個循環；熔解曲線分析：95℃ 10s，65℃ 60s，97℃ 1s。所有引物都由上海生工生物工程公司合成，具體序列見表1。采用2-△△Ct方法計算mRNA相對表達量。

表1 引物序列Tab.1 primer sequence

1.4.6 比色法檢測Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、SDH活力

1.4.6.1 比色法檢測Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力 稱量大鼠肝臟組織50mg，按質量:體積（g:mL）=1:9的比例，在1.5mL離心管中加入0.9%氯化鈉溶液450μL，放入冷凍混合離心儀中充分研磨。研磨充分后，2 500r/min離心10min，取上清液，制成10%上清液勻漿，再用0.9%氯化鈉溶液稀釋成1%。用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。配置基質液，定磷，充分混勻，室溫靜置5min，在636nm處，1cm光徑，雙蒸水調零，測定各管吸光度。計算公式如下：

1.4.6.2 比色法檢測SDH活動 按照試劑一:試劑二:試劑三:試劑四:試劑五:試劑六=2:0.1:0.1:0.2:0.1:0.1的比例配置工作液，配好后避光保存，并37℃預溫5 min以上。在96孔板中加入10μL待測大鼠血漿樣本，快速加入260μL工作液。在酶標儀中5s讀取一次吸光度（A1值），1分5s再次讀取一次吸光度（A2值），求出2次吸光度差值（△A=A1-A2）。計算公式如下：

1.5 統計學分析 采用SPSS 18.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以±s表示，多組間比較滿足方差齊性時采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法；多組間比較方差不齊時采用Kruskal-Wallis H檢驗。計數資料采用率或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較 造模15d后，紅參高、中、低劑量組大鼠均出現不同程度毛發蓬松，煩躁多動的表現，體質量增長緩慢，肛溫升高，飲食飲水量增多，大便偏干，小便黃赤、量多。正常對照組活動正常，體質量增長平穩，肛溫無明顯升高，飲食、飲水量無明顯增多。

2.2 各組大鼠體質量比較 造模第1天，各組大鼠體質量差異無統計學意義（P＞0.05）。造模后第15天，與正常對照組比較，紅參各劑量組大鼠體質量增長緩慢，其中紅參高、中劑量組大鼠體質量的差異有統計學意義（P＜0.05）；低劑量組體質量的差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。

表2 各組大鼠體質量比較（±s，g）Tab.2 Comparison of weight of each group(±s，g)

表2 各組大鼠體質量比較（±s，g）Tab.2 Comparison of weight of each group(±s，g)

注：與正常對照組相同時點比較，*P＜0.05。Note:Compared with normal control group at the same time,*P＜0.05.

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2.3 各組大鼠肛溫比較 造模第1天，各組大鼠肛溫差異無統計學意義（P＞0.05）。造模第15天，與正常對照組比較，紅參高、中、低劑量組大鼠的肛溫均升高，其中高劑量組的肛溫差異有統計學意義（P＜0.05）；中、低劑量組的肛溫差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠體溫比較（±s，℃）Tab.3 Comparison of temperature of each group(±s，℃)

表3 各組大鼠體溫比較（±s，℃）Tab.3 Comparison of temperature of each group(±s，℃)

注：與正常對照組相同時點比較，*P＜0.05。Note:Compared with normal control group at the same time,*P＜0.05.

組別 第1天 第15天紅參高劑量組紅參中劑量組紅參低劑量組正常對照組38.13±0.55 38.08±0.52 38.23±0.37 38.16±0.53 38.63±0.42*38.57±0.91 38.45±0.70 38.14±0.77

2.4 各組大鼠進食、飲水、糞便、尿量比較 造模第15天，與正常對照組比較，紅參高、中、低劑量組大鼠的進食、飲水量均有增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。紅參高、中劑量組糞便量增多，低劑量組糞便量減少。其中中劑量組的糞便量增多，差異有統計學意義（P＜0.05）；高、低劑量組大鼠的糞便量差異無統計學意義（P＞0.05）。紅參高、中、低劑量組大鼠的尿量均增加。其中中劑量組的尿量增多，差異有統計學意義（P＜0.05）；高、低劑量組大鼠的尿量差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠進食、飲水、糞便、尿量比較（±s）Tab.4 Comparison of diet,drinking,feces and urine of each group(±s)

表4 各組大鼠進食、飲水、糞便、尿量比較（±s）Tab.4 Comparison of diet,drinking,feces and urine of each group(±s)

注：與正常對照組比較，*P＜0.05。Note:Compared with normal control group,*P＜0.05.

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2.5 各組大鼠TSH、17-OHCS表達比較 造模第15天，與正常對照組比較，紅參高、中、低劑量組大鼠TSH以及17-OHCS含量均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.001）。見表 5。

表5 各組大鼠TSH、17-OHCS表達比較（±s）Tab.5 Comparison of TSH,17-OHCS of each group(±s)

表5 各組大鼠TSH、17-OHCS表達比較（±s）Tab.5 Comparison of TSH,17-OHCS of each group(±s)

注：與正常對照組比較，***P＜0.001。Note:Compared with normal control group,***P＜0.001.

組別 TSH（mU·L-1） 17-OHCS（μmol·L-1）紅參高劑量組紅參中劑量組紅參低劑量組正常對照組12.92±0.94***11.03±0.91***9.39±0.93***7.16±1.12 40.33±1.11***34.18±2.86***29.26±2.79***22.27±3.54

2.6 各組大鼠AMPK及下游PGC-1α、NRF1的表達比較

2.6.1 各組大鼠AMPK、PGC-1α、NRF1蛋白表達比較 造模第15天，與正常對照組比較，紅參高、中、低劑量組AMPK、NRF1的蛋白表達上調，差異有統計學意義（P＜0.05）。低劑量組PGC-1α蛋白表達上調，但差異無統計學意義（P＞0.05）。紅參高、中劑量組PGC-1α蛋白表達均上調，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 1。

2.6.2 各組大鼠AMPK、PGC-1α、NRF1 mRNA表達比較 與正常對照組比較，紅參高、低劑量組的AMPK、PGC-1α、NRF1 mRNA 表達量均上調，差異均有統計學意義（P＜0.05）；中劑量組的 AMPK、PGC-1α、NRF1 mRNA表達量亦上調，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 2。

圖1 各組大鼠的AMPK、PGC-1α、NRF1蛋白比較Fig.1 Comparison of protein expression of AMPK,PGC-1α,NRF1 of each group

2.7 各組大鼠SDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力比較 造模第15天，與正常對照組比較，紅參各劑量組大鼠SDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力均升高。其中紅參高、中劑量組SDH活力高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），低劑量組差異無統計學意義（P＞0.05）。紅參高、中劑量組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.001），低劑量組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表6。

圖2 各組大鼠AMPK、PGC-1α、NRF1 mRNA表達比較Fig.2 Comparison of mRNA of AMPK,PGC-1α,NRF1 of each group

表6 各組大鼠SDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力比較（±s）Tab.6 Comparison of activity of SDH,Na+-K+-ATP enzyme,Ca2+-Mg2+-ATP enzyme of each group(±s)

表6 各組大鼠SDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力比較（±s）Tab.6 Comparison of activity of SDH,Na+-K+-ATP enzyme,Ca2+-Mg2+-ATP enzyme of each group(±s)

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Note:Compared with normal control group,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.64±0.18***2.44±0.30***2.01±0.25 1.83±0.14組別 SDH（U·mL-1） Na+-K+-ATP 酶（U·mgprot-1） Ca2+-Mg2+-ATP 酶（U·mgprot-1）紅參高劑量組紅參中劑量組紅參低劑量組正常對照組49.30±3.77*51.54±2.96*48.53±3.41 44.57±3.70 3.04±0.27***2.69±0.29**2.51±0.28 2.23±0.12

3 討論

紅參是五加科植物人參的栽培品經蒸制后的干燥根及根莖，其味甘，微苦，性溫，香味濃厚。歸脾、肺、心、腎經，具有大補元氣、復脈固脫、益氣攝血的功效[5]。高麗紅參是指朝鮮半島出產的人參，完全成熟的高麗紅參通常選用生長了6年的人參炮制而成，是稀有的珍品。因此，高麗紅參是老百姓熱衷的補品之一。《素問·陰陽應象大論》曰：“氣厚者為陽，薄為陽之陰……氣薄則發泄，厚則發熱。”紅參性溫，當屬氣厚者，氣厚者有助陽發熱的作用。過服或久服會影響陰陽偏頗，造成人體陽氣的病理性亢盛，出現一派實熱上火的癥狀。因此，紅參的溫性與上火的發生密切相關。現代研究運用微量量熱法測定紅參的生物熱效應，證實其性偏熱。溫熱藥作用于機體一般表現為功能的亢奮，機體功能亢奮則需要消耗較多的能量,就會產生較多的熱量[6]，故推斷其引起的熱量蓄積可能是造成上火的機制之一。

目前尚無關于上火動物模型的文獻報道。從中醫八綱辨證而言，實熱上火屬于實熱證的范疇。因此，本實驗借鑒了實熱證的造模方法，用高麗紅參煎液灌胃大鼠15d，建立實熱上火的動物模型。大鼠出現體重增長緩慢，肛溫升高明顯，進食、飲水量均增加，大便偏干，小便黃赤、量多等表現，與中醫上火的臨床表現相近。

血中TSH是由腺垂體分泌的一種糖蛋白，是直接調節甲狀腺功能的關鍵激素[7]385,396。TSH是反映下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能的敏感指標，甲狀腺功能改變時，TSH的波動較T3、T4更迅速而顯著[8]45。因此，TSH可反映下丘腦-垂體-甲狀腺軸的功能。17-OHCS主要是指腎上腺皮質分泌的皮質醇、皮質素和它們的代謝產物，由腎臟排出，所以測定血中17-OHCS可以反映交感神經-腎上腺皮質功能[7]408。當腎上腺皮質功能亢進時，外周17-OHCS的排出量增加。文獻報道，溫熱藥有提高交感神經-腎上腺系統活性的作用，包括下丘腦-垂體-腎上腺皮質、下丘腦-垂體-甲狀腺等[8]43。本實驗用ELISA法檢測紅參上火大鼠模型的血清TSH、17-OHCS后發現，各組別TSH、17-OHCS含量相比正常對照組均明顯升高。該結果體現了紅參的溫熱性質，也說明了紅參上火模型存在交感神經-腎上腺功能的增強。結合大鼠精神煩躁多動、體重增長緩慢、肛溫升高、飲食飲水量增多、大便偏干、小便黃赤等體征，提示實熱上火動物模型的建立。此外，大鼠肛溫、體質量、飲食、飲水量等實熱上火表現以及TSH、17-OHCS的表達量升高與紅參給藥量呈正相關關系，說明了過量進補紅參，會引起上火。

課題組前期研究發現，上火存在能量代謝的紊亂。AMPK能感知細胞能量代謝狀態的改變，活化的AMPK可以增強分解代謝，抑制合成代謝，參與細胞糖、脂肪、蛋白質代謝等能量代謝過程，增加細胞能量儲備，應對能量缺乏。活化的AMPK可以通過調節過下游PGC-1α和NRF1提高線粒體能量代謝[9-11]。PGC-1α是一個轉錄共激活因子，具有線粒體生物合成、肌纖維類型的轉化、葡萄糖代謝、脂肪酸氧化等功能[12]。它與能量代謝關系密切，且具有組織表達的特異性，主要在能量需求較高、線粒體豐富的組織中表達[13-14]。活化的AMPK通過直接作用于下游PGC-1α的Ser538和Thr177殘基，促進其轉錄，進而促進線粒體基因表達和線粒體生成[15]。PGC-1α能激活NRFs形成復合物，有效增強線粒體DNA的復制與轉錄過程，調節線粒體生物合成。研究發現，紅參及人參皂苷均有活化AMPK的作用，在代謝相關性疾病的調控中發揮重要的作用[3-4，16]。本實驗發現，與正常對照組比較，高、中劑量組大鼠 AMPK、PGC-1α、NRF1 的蛋白表達均上調。高、低劑量組大鼠AMPK、PGC-1α、NRF1 mRNA表達均上調。因此，筆者認為紅參上火模型大鼠存在AMPK功能活化，活化的AMPK作用于下游PGC-1α及NRF1等因子，促進線粒體生物合成和ATP的產生，增強機體的能量代謝。提示了紅參引起的上火存在能量代謝的增強，其機制可能與紅參活化AMPK有關。

SDH是葡萄糖糖代謝三羧酸循環途徑中一種重要的酶，也是線粒體內膜氧化呼吸鏈復合體的組成酶之一[17]，具有催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸的作用[18-19]。它的活力反映了三羧酸循環、組織氧化代謝水平及機體的能量生成情況[20]。研究發現，AMPK能調節SDH的活力[21-22]。實驗發現，實熱上火模型SDH活力升高，說明了三羧酸循環的加快以及線粒體中ATP合成增加，提示了能量代謝處于旺盛的狀態，其機制可能與AMPK活化后上調SDH活力有關。

Na+-K+-ATP酶又稱為鈉-鉀泵，簡稱鈉泵。它對維持細胞的正常生理功能起著極其重要的作用，可將細胞內的ATP水解為二磷酸腺苷（adenosine diphos－phate，ADP），并利用高能磷酸鍵貯存的能量完成Na+、K+的跨膜轉運[7]15。與ATP的分解和利用有關，故Na+-K+-ATP酶活力是反映機體能量代謝水平和生理功能狀態的重要指標[23]。Ca2+-Mg2+-ATP酶又稱為鈣泵，機制與鈉泵相似[7]16。二者是衡量線粒體功能和能量代謝水平的重要指標[23]。研究發現，AMPK對鈉泵、鈣泵具有促進作用[24-25]。因此，本實驗進一步檢測了Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶含量的變化來反映能量代謝的變化。本研究發現，紅參高、中劑量組Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶含量均高于正常對照組，且差異具有統計學意義。說明了線粒體中ATP分解代謝增強，提示了機體能量代謝處于旺盛的狀態，其機制可能與AMPK上調了鈉泵、鈣泵活力有關。

綜上所述，紅參引起的實熱上火大鼠模型存在能量代謝增強，其機制與紅參引起AMPK活化，進一步導致其下游能量代謝相關因子PGC-1α、NRF1表達上調，能量代謝相關的琥珀酸脫氫酶、鈉泵、鈣泵活力升高有關。該結果提示了上火與能量代謝增強的相關性，但其與葡萄糖代謝、脂肪酸代謝等能量代謝過程的具體關聯還有待進一步研究。