“上火”人群的腸道微生物結構特征研究

浙江中醫藥大學基礎醫學院中醫臨床基礎研究所 杭州 310053

“上火”是中醫學上特有的病名，屬于“火熱證”范疇。調查顯示在中國91%的成年人有過“上火”經歷[1]。“上火”癥狀表現形式多樣，包括口腔潰瘍、牙齦紅腫、唇周面部皰疹、雙目紅赤、口干眼干、尿赤、便秘等。現代醫學把“上火”視為“亞健康”狀態和代償范圍內的急性應激反應，是免疫功能下降時出現的炎癥和局部感染[2]。現代醫學對“上火”相關病證的研究發現，其發病多與環境、飲食、情志、遺傳、免疫、微生物等因素相關[3]。

情志刺激、過食辛辣燥熱、勞累過度和微生物感染等因素可引起體內微環境變化，導致黏膜上皮組織的糖酵解功能活躍，從而導致能量代謝紊亂，進一步引起黏膜損傷，使黏膜免疫系統中Th17/Treg細胞比例上調，分泌型免疫球蛋白A（immunoglobulin A,I－gA）分泌減少，局部黏膜免疫力下降，易繼發感染，進而加重黏膜損傷[4]。因此，“上火”人群中普遍存在著體內能量代謝的紊亂及黏膜免疫的異常。

近年來，研究證實腸道微生物在機體能量代謝和黏膜免疫方面發揮重要作用[5-6]。腸道微生物通過多條途徑參與機體的能量代謝，包括對不能被人體細胞消化的膳食纖維進行酵解、對肽類或蛋白質進行無氧酵解、膽汁酸的生物轉化和草酸鹽復合物的降解等[7]。另外，腸道菌群可通過在腸道中定植，構建腸道免疫屏障；腸道細菌在死亡或增殖時，不斷向外界釋放脂多糖、肽聚糖或磷脂壁酸等刺激物，這些物質進入血液，從而引起全身黏膜免疫反應[6]。綜上所述，腸道菌群可通過影響能量代謝和黏膜免疫，參與“上火”的發生。

為明確“上火”人群的腸道菌群結構特征，本研究采用Illumina MiSeq測序技術檢測“上火”人群和健康人群的腸道菌群結構，進一步了解“上火”相關的腸道菌群種類的變化。

1 材料和方法

1.1 樣本來源 樣本采集時間為2016年8月至2017年5月,采集對象為浙江中醫藥大學全日制各專業在讀本科生。所有研究對象均自愿加入“上火”項目研究，均符合相應的中醫診斷標準、“上火”人群和健康人群的納入標準及排除標準。

1.2 診斷標準、納入標準和排除標準

1.2.1“上火”人群診斷標準 采用專家咨詢法，確定“上火”的診斷標準：1個主癥（頭面部癥狀）或2個次癥（至少1個為頭面部癥狀）。主癥：牙齦腫痛、咽喉腫痛、口臭、口腔潰瘍、鼻瘡癤、熱瘡（顏面部皰疹）、口苦和目赤干澀。次癥：口角糜爛、目眵增多、口渴、舌痛、痤瘡、鼻腔干燥、齒衄、鼻衄、聲音嘶啞、頭痛、大便干結、小便黃、心煩、五心煩熱、多食易饑、痔瘡發作、潮熱和失眠。

1.2.2 健康人群入選標準 正常對照組為健康的大學生，近半年內無“上火”病史（根據前文提到的“上火”診斷標準），無心腦血管病史及其他重大內科疾病史，無結核、傷寒或肝炎等傳染病史；三大常規、肝腎功能、胸片、B超、心電圖等指標無明顯異常；體格檢查無明顯異常；近1個月內無腹瀉或胃腸病史，無用藥及服用微生態制劑史；無吸煙、飲酒等不良嗜好；舌質淡紅，苔薄白，脈象正常。

1.2.3 納入標準 （1）符合“上火”的診斷標準；（2）符合上述標準的健康體檢者；（3）年齡18～35歲；（4）自愿參加本實驗并簽署臨床研究知情同意書。

1.2.4 排除標準 （1）由于抗生素、激素等藥物的使用引起“上火”表現者；（2）有重大內科疾病、消化道疾病者或精神疾病不能配合者；（3）妊娠或哺乳期婦女；（4）存在研究者認為不適合納入的其他情況。

1.3 樣本采集 樣本采集前，采用調查問卷形式詳細記錄受試者的年齡、性別、身高、體質量、飲食習慣及飲食結構等特征，記錄中醫證候。糞便樣本采集前，先排凈小便，防止尿液污染糞便。用無菌一次性采樣杯采集新鮮糞便樣本后置于冰盒內，迅速將糞便運回實驗室進行按20mg/管分裝，隨即置于-80℃冰箱中保存。

1.4 標本收集及檢測

1.4.1 糞便DNA提取、擴增和測序 采用糞便DNA提取試劑盒QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（德國Qiagen公司產品，批號：51304）抽提糞便DNA。檢查DNA濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。合格后，采用16S rRNA基因的V3-V4區引物對基因組進行擴增。擴增引物上下游分別是上游5’-X-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’ 和 下 游 5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，引物由Invitrogen公司合成，“X”為區別不同樣本的8個隨機組合的核苷酸堿基片段（barcode）。PCR擴增前，模板濃度統一稀釋到 20ng·μL-1。擴增體系如下：5×反應緩沖液 5μL、5×GC 緩沖液 5μL、100mmol·L-1dNTP 5μL、10μmol·L-1上游引物 1μL、10μmol·L-1下游引物 1μL、DNA 模板2μL、ddH2O 6μL。反應總體系共 25μL。反應條件：初始變性 98℃ 2min，變性 98℃ 15s，退火 55℃ 30s，延伸72℃ 30s，共25個循環。72℃延伸5min，10℃保存。

PCR擴增產物質檢合格后，進行文庫構建，采用Illumina MiSeq測序平臺進行250bp×2雙末端測序；下機進行測序原始數據整理、過濾及質量評估；序列進行質控過濾后，接下來進行操作分類單元（operational taxonomic units,OTUs）列表生成及注釋。

1.4.2 數據整理、過濾及質量評估 測序完成后，對原始數據進行處理，步驟如下：（1）采用滑動窗口法對雙端的FASTQ序列進行質量過濾，截掉質量低的數據；（2）利用FLASH軟件（v1.2.7）對通過質量初篩的雙端序列根據重疊堿基進行配對連接，并根據barcode序列將序列拆分，各自回歸到對應樣品；（3）運用QIIME軟件（v1.8.0）識別疑問序列，保留長度＞150bp和不存在模糊堿基N的序列，并調用USEARCH（v5.2.236）檢查并剔除嵌合體序列，從而獲得最后用于分析的序列。

1.4.3 多樣性和群落結構分析 調用QIIME軟件中的UCLUST程序，對獲得的序列按97%的序列相似度進行歸并和OTU劃分，根據OTU在每個樣本中所包含的序列數，構建OTU在各樣本中豐度的矩陣文件。采用QIIME軟件對樣品序列進行Alpha多樣性分析，包括ACE指數和Chao1指數，并采用SPSS 16.0統計軟件進行兩類人群間單因素方差分析。選擇OTUs中的一條代表序列（默認豐度最高），采用Ribosomal數 據 庫 （Ribosomaldatabase project，RDP）進行OTU分類地位鑒定。使用R軟件，根據OTU豐度矩陣和樣本分組數據構建PCoA分析，評估微生物群落的整體差異；根據OTU豐度矩陣表，使用在線分析軟件LEfSe（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy）分析健康人群與“上火”人群間差異的腸道菌群種類，線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）得分大于 2，且 Kruskall-Wallis檢驗值小于0.05即為差異顯著。

2 結果

2.1 受試者臨床樣本信息統計分析 根據上述診斷、納入及排除標準，共納入35例“上火”人群，男女比例為0.84:1，平均年齡為24.4歲，平均體重指數（body mass index，BMI）為 23.2kg/m2。為匹配“上火”人群的樣本信息，同時收集了健康人群35例，男女比例為0.67:1，平均年齡為23.7歲，平均BMI為22.3kg/m2。見表1。兩組基本信息采用方差分析比較，結果顯示組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

表1 臨床研究人群基本信息Tab.1 Basic information of clinical study population

2.2 兩組受試者Alpha多樣性指數比較分析 本研究采用Chao1和ACE兩種Alpha多樣性指數反映健康人群和“上火”人群的腸道菌群多樣性。“上火”人群的腸道微生物多樣性平均指數均低于健康人群，但兩組之間無統計學差異（P＞0.05）。一般來說，Alpha多樣性指數值越高，表明群落的多樣性越高。因此，“上火”可能會導致腸道菌群多樣性略微降低。見圖1。

圖1 健康人群與“上火”人群的Alpha多樣性指數比較Fig.1 Comparison of Alpha indices between healthy and“Shanghuo”individuals

2.3 兩組受試者Beta多樣性比較分析 健康人群和“上火”人群的腸道菌群差異可以通過PCoA分析進行歸類，PC1和PC2分別為12.94%和6.26%。兩種人群在PCoA圖上均能各自聚類，但有部分重疊，說明兩類人群的腸道菌群Beta多樣性具有差異。見圖2。

2.4 健康人群與“上火”人群的差異腸道菌群分析圖3展示了健康人群和“上火”人群之間的差異腸道菌群發育樹圖，由LEfSe在線分析程序獲得，其中顯著差異的logarithmic LDA score設為3。綠色節點代表健康人群高于“上火”人群的腸道菌群種類，紅色節點代表“上火”人群顯著高于健康人群的腸道菌群種類。

圖2 基于OTU豐度矩陣表的PCoA判別分析Fig.2 PCoA analysis based on OTU abundance of gut microbiome individuals.

圖3 健康人群與“上火”人群間差異腸道菌群的LEfSe分析Fig.3 LEfSe analysis reveals the significantly different gut microbiota between healthy and“Shanghuo”individuals

在微生物門水平上，健康人群與“上火”人群間顯著差異的種類包括6個，分別是放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和迷蹤菌門（Elusimicrobia），前三個門在“上火”人群腸道內含量顯著上調，后三個門在“上火”人群腸道內含量顯著下調。

在微生物屬水平上，LEfSe共鑒定出13個屬在兩種人群中存在顯著差異。在放線菌門（Firmicutes）中，包括8個顯著差異屬，分別是厭氧管狀菌屬A（Naerofustis）、布勞特菌屬（Blautia）、棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）、顫螺菌屬（Oscillospira）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、厭氧弧菌屬（Anaerovibrio）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium） 和糞芽孢菌屬（Coprobacillus），它們均在“上火”人群中顯著上調。變形菌門（Proteobacteria）包括2個在“上火”人群腸道內顯著上調的屬，分別是固氮螺菌屬（Azospirillum）和叢毛單胞菌屬（Comamonas）。除了在“上火”人群中上調的微生物屬，還包括“上火”人群中下調的微生物屬，分別是擬桿菌門（Bacteroidetes）中的B擬桿菌屬（Acteroides）和普氏菌屬（Prevotella），及螺旋體門（Spirochaetes）中的密螺旋體屬（Treponema）。在放線菌門（Actinobacteria）和迷蹤菌門（Elusimicrobia）中未發現顯著差異的屬。

3 討論

中醫認為“上火”者體內會出現陰陽失衡、火熱旺盛，導致能量代謝紊亂及黏膜免疫失調。腸道微生物可參與機體能量的產生、轉化、儲存和利用，并通過改變組織對能量的利用方式和AMP依賴的蛋白激酶（adenosine 5’monophosphate activated protein kinase，AMPK）磷酸化等途徑來影響機體的能量代謝[8]；同時，腸道菌群可調控免疫效應因子，如sIgA的產生，以及模式識別受體如Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）等的活化，從而影響機體的腸道黏膜免疫[9]。因此，本研究結果揭示的“上火”人群腸道微生物的變化，有助于解析“上火”能量代謝物紊亂和黏膜免疫失調的現象。

在腸道微生物中，厚壁菌門（Firmicutes）與擬桿菌門（Bacteroidetes）是兩個占主要地位的門，兩者比例在90%以上[6]。厚壁菌門（Firmicutes）與擬桿菌門（Bacteroidetes）比例的上調指示了肥胖患者腸道內的慢性炎癥發生[10]。在“上火”人群腸道內，厚壁菌門/擬桿菌門的比例也出現明顯上調，這說明“上火”人群的腸道內可能存在炎癥。除此之外，食用肉類增加或食用纖維素下降可上調厚壁菌門/擬桿菌門的比例[11]，上述飲食習慣也是“上火”的主要誘因。

在微生物屬水平上，某些變化的腸道微生物屬與“上火”相關的能量代謝紊亂相關。顫螺菌屬（Oscillospira）能幫助宿主細胞降解糖類物質，從而提供能量[12]；瘤胃球菌屬（Ruminococcus）通過產生短鏈脂肪酸類物質為宿主細胞提供能量[13]；考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）在腸道內可通過降解琥珀酸鹽為宿主提供能量[14]。因此，這些與宿主能量代謝相關的菌屬在“上火”人群中上調，可能是引起能量代謝紊亂的因素之一。另外，某些變化的腸道微生物屬也與“上火”相關的免疫失調相關：瘤胃球菌屬（Ruminococcus）豐度上調，可導致腸道黏膜層降解，腸道屏障不穩定和輕度黏膜免疫失調[15]；普氏菌屬（Prevotella）通過活化TLR2，調控Th17細胞相關的免疫因子，從而引起黏膜免疫失調[16]；棲糞桿菌屬（Faecalibacterium）可通過調控核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）途徑，抑制炎癥反應,幫助宿主機體抵抗炎癥[17]。

綜上所述，本研究結果證實“上火”發生與腸道菌群改變相關，變化的腸道菌群在一定程度上能反映“上火”導致的能量代謝紊亂和黏膜免疫失衡。