草魚魚種細菌性敗血癥病原的分離與鑒定

■ 陳昌福 曹麗敏 陳輝 方蘋

（1 華中農業大學，武漢 430070；2 沈陽元豐飼料有限公司，沈陽 110202；3 江蘇省漁業技術推廣中心，南京 210029 ）

今年5月初，遼寧省沈陽市遼中區的養殖草魚（Ctenopharyngodon idellus）出現大范圍疾病流行，而且死亡率比較高。患病草魚出現比較典型的細菌性敗血癥的癥狀，主要特征是身體發黑、部分鱗片松動、脫落，鰭條基部有出血現象，部分病魚的肛門紅腫，鰓上有大量黏液并且附有污泥。解剖病魚檢查，可見腹腔內有腹水，腸道內少有食物，腸道發紅、腸道內有充氣的現象。

對具有上述癥狀的病魚，利用微生物學操作技術，從和患病魚體的腎臟和肝胰臟中進行了致病菌的分離和鑒定。現將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 患病魚的來源與規格

用于分離致病菌的患病魚，主要取自遼寧省沈陽市遼中區劉二堡鎮及其周邊水產養殖區域內成魚養殖池塘。患病草魚規格大多為100.0～200.0g的二齡草魚魚種，也有部分體重約為1,000.0g的大規格草魚。

1.2 致病菌株分離與純化

從養殖池塘中撈取魚體發黑、離群獨游于池塘邊上的患病草魚，將活體帶回實驗室。在無菌條件下解剖魚體后，從其腎臟和肝胰臟中取樣，接種在盛有BHIA（Diffco）培養皿中。將接種好的培養皿，置于25℃恒溫培養箱中培養48h后，從培養皿中挑取單個菌落，轉接于BHIA培養皿中，進行純化培養48h。

1.3 接種活菌與菌株再分離

從分離純化的多個菌株中，隨機取14個優勢菌株接種在BHIA（Diffco）培養皿中，在25℃恒溫培養箱中純培養48h后，用滅菌生理鹽水洗下培養皿中的菌落，將其菌體濃度調節成107cells/mL活菌液。對平均體重約100.0g的正常小草魚，經胸鰭基部對每尾注射0.2mL菌液后，將其放回水族箱中繼續飼養觀察。待供試魚出現與自然條件下相似的細菌性敗血癥癥狀后，撈取具有典型疾病癥狀的患病魚體，在無菌條件下從其腎臟和肝胰臟中再次分離菌株。將這些再分離菌株與初分離并用于接種供試魚的菌株，通過分子生物學和理化特性鑒定的方法，鑒定其菌株的種屬。

表1 分離菌株人工感染草魚后的發病、死亡時間與死亡率

1.4 菌株的鑒定

1.4.1 根據菌株的16S rDNA鑒定

將初次分離的14個菌株和再分離的10個菌株純化培養后，寄送給生工生物工程（上海）股份有限公司，委托其檢測菌株的16S rDNA。

1.5 根據菌株的理化特性鑒定

按照《細菌鑒定手冊》（第八版）和《常見細菌系統鑒定手冊》的鑒定參數，分別對初次分離的14個菌株和再分離的10個菌株，進行了理化特性鑒定[1,2]。

2 結果

2.1 接種活菌后供試魚發病情況

對平均體重約為100.0g的正常小草魚經胸鰭基部注射0.15～0.2mL活菌液后，供試魚發病情況如表1中所示。由表1所示結果可以看出，經過接種不同菌株活菌液后，供試魚出現細菌性敗血癥的情況和死亡數量是有所不同的，顯示出了菌株的毒力存在差異。

2.2 菌株的種屬

將初次分離和再次從患病魚體中分離的部分致病菌株，進行分子生物學和理化特性鑒定結果如表2所示。由表2所示結果可以看出，檢測菌株的16S rDNA的分子生物學和理化特性鑒定結果是完全一致的。初次分離的14個菌株中有12個菌株是屬于A.hydrophila，只有2株是屬于A.sobria。而從人工致病的魚體中再次分離到的10個菌株，則均屬于A.hydrophila。

表2 從患病草魚體內初分離和再次分離菌株的鑒定

3 討論

淡水魚類細菌性敗血癥主要是由氣單胞菌屬（Aeromonas）的幾種細菌引起。本研究的結果證實，從遼寧省遼中養殖區域患細菌性敗血癥草魚體內分離的大部分能菌株，均屬于A.hydrophila，只有少數的屬于A. sobria。

淡水魚類細菌性敗血癥具有發病急、死亡率高的特點，一旦疾病暴發性地流行起來，要有效地控制疾病損失就比較困難了。迄今為止，對于養殖魚類細菌病的防控主要有兩條途徑，即免疫防控與藥物防控。農業農村部雖然已經批準了一種嗜水氣單胞菌的滅活疫苗[3]。但是，因為各種原因這種疫苗至今為止應用范圍尚不廣泛。

我國雖然有幾種允許用于細菌性疾病治療的抗菌素類漁藥。但是，由于長期以來沒有對水產養殖動物致病菌藥物敏感性監測數據，導致在采用藥物治療水生動物疾病時，難以做到科學、精準使用這些藥物，藥物治療水生動物疾病的效果也就很難期待[4]。

本研究正是有鑒于上述問題存在，通過對分離菌株進行藥物敏感性測定，為藥物治療魚類這種細菌性疾病篩選合適藥物和確定用藥劑量。此外，還將通過研究這些菌株免疫原性和抗原性差異，從中篩選制備“自家疫苗”的菌株，研制能用于遼寧省遼中養殖區域的“自家疫苗”，進行對該養殖區內養殖草魚細菌性敗血癥的免疫防控[5]。

（參考文獻略）