東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅內生酵母菌多樣性分析

劉開平，韋玉梅，熊 杰，孫燕飛，雷勇輝

（1.石河子大學生命科學學院，新疆 石河子 832003；2.石河子大學農學院，新疆 石河子 832003）

蝗蟲屬直翅目，全世界種類超過10 000種，我國有1 000余種。蝗蟲主要包括飛蝗和土蝗，飛蝗在我國有東亞飛蝗〔Locusta migratoria manilensis（Meyen）〕、 亞 洲 飛 蝗〔Locusta migratoria migratoria（Linnaeus）〕和西藏飛蝗〔Locusta migratoria tibitensis（Chen）〕3 種，其中東亞飛蝗分布范圍最廣，具有繁殖能力強、食量大、遷飛、抵抗不良環境能力強等特點，一旦爆發成災，常常導致顆粒無收，給農業生產和社會穩定造成嚴重危害［1］。刺腿食蚜蠅是常見的昆蟲天敵，以幼蟲捕食蚜蟲而著稱［2］，在農業生態系統中是一種益蟲。

近年來，昆蟲體內共生菌的研究越來越引起國內外研究者的重視。在長期的協同進化過程中，昆蟲與其體內的共生菌建立了密切的互利共生關系，內共生菌是宿主昆蟲生長發育及適應性的重要調控因子［3］。有研究表明，刺吸危害的同翅目昆蟲，如蚜蟲、飛虱、葉蟬等，體內普遍存在內共生菌。大多數同翅目昆蟲的共生菌，除了在短期的卵巢感染階段外，很少情況下在菌胞（Mycetocyte）外發現；蚜蟲共生菌的種類主要有初級共生菌布赫納氏菌（Buchnera aphidicola）和若干次級共生菌，如沙雷氏菌 （Serratia symbiotica）、立克次氏體（Rickettsiaspp.）、沃爾巴氏菌（Wolbachiaspp.）、U型共生腸桿菌（egiella insecticola）、T 型共生腸桿菌 （Hamil-tonella defensa）等［4］，但目前關于昆蟲共生酵母菌的研究鮮為報道。在“昆蟲·共生菌”這一共生關系研究中，共生菌的離體培養至關重要［5］，而傳統可培養方法對昆蟲內生菌不同分類水平菌群結構的多樣性難以進行全面深入研究，隨著分子生物學技術的發展，高通量測序技術已開始逐步應用于微生物多樣性研究。26S rDNA的D1/D2區域的序列保守程度適中，長度適中（約600 bp），可以作為酵母菌種級水平鑒定指標，在微生物高通量測序研究中應用廣泛。對大量子囊菌酵母26S rDNA的D1/D2區域的序列進行分析發現，同種但不同菌株之間該區核苷酸替換率低于1%，通過對該序列的研究可以將假絲酵母屬（Candida）絕大部分種區分開［6］。對卵塊培養法分離得到的褐飛虱體內的兩株菌的26S rDNA D1/D2區序列測序分析，發現分別與解脂假絲酵母（Yarrowia lipolytica）和嗜鹽梗孢酵母（Sterigmatomyces halophilus） 具 有 100% 和99.8%序列相似性［7］。至今，國內外尚無有關東亞飛蝗和食蚜蠅體內的酵母共生菌的離體培養報道，這嚴重阻礙了該類共生菌的生理生化特性實驗的開展。而作為單細胞個體，其常規的形態分類又受到很大的限制，從而使得該類共生菌的分類研究至今止步不前。

本研究首次采用Illumina MiSeq高通量測序方法對2種昆蟲酵母菌26SrDNA進行分析，探討農業害蟲東亞飛蝗及益蟲刺腿食蚜蠅這兩種不同類型昆蟲內生酵母菌的多樣性差異，并為農業害蟲防治和特殊環境下的特殊微生物資源利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在石河子市分別采集東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅2種昆蟲各30只，采樣信息見表1。

表1 不同采樣點地理因子

1.2 東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅內生菌基因組DNA提取及測序

將所得樣本昆蟲用酒精進行表面消毒后用無菌水清洗，再用研缽在無菌間研磨成勻漿，然后將所得原液與無菌水按1∶1比列混合，并用0.45 μm的濾膜進行抽濾，然后利用試劑盒提取基因組DNA （Powersoil?DNA isolation kit）。根據Kurtzman等［8］的方法，用通用引物NL-1和NL-2 PCR擴增酵母26S rDNA的D1/D2區域。PCR擴增體系（50 μL）：dd H2O 38 μL，10×Taq E Buffer 5 μL，dNTPs（2.5mmol/L）4 μL，引物NL-1 和NL-4各1 μL，混勻，再分別加入模板DNA 0.5μL，Taq聚合酶（5 U/ L）0.5 μL，混勻后稍微離心。然后按照程序94℃，1 min；53℃，1 min；72℃，1 min 20 s進行36個循環。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定，用Axygen DNA凝膠回收試劑盒（Axygen，美國）進行割膠回收。送樣至上海派森諾生物科技有限公司對樣品26S rDNA D1/D2區進行高通量測序，利用Illumina（MiSeq）平臺，對獲得的序列進行OTU歸并劃分，每個OTU的代表序列用于分類地位鑒定，在屬水平對菌群進行聚類分析，根據聚類結果分析東亞飛蝗和刺腿食蚜體內酵母群落豐富度的差異。

1.3 多樣性分析

基于OTU聚類結果，利用Mothur軟件計算東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅體內酵母菌Alpha多樣性，包括Chao1指數、Ace指數、Shannon指數及Simpson指數［9］，作為測序數據量不同樣本中物種豐富度比較的依據，也可作為樣本測序量合理與否“是否足以覆蓋所有類群”的評價標準，得出樣本測序深度。并通過SPSS統計分析軟件對2個樣本的多樣性指數差異的顯著性分析［10］，反映東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅體內絕大多數酵母菌的信息。

1.4 物種組成分析

獲得的OTU與RDP數據庫（Release 11.1，http:// rdpcme.msu.edu/）比對，通過 RDP Classifier鑒定OTU代表性序列的微生物分類地位。各組樣品在不同水平的分類比較柱形圖是根據QIIME（v1.8.0）軟件計算的結果用Origin軟件繪制［11］。

2 結果與分析

2.1 東亞飛蝗與刺腿食蚜蠅酵母菌OUT水平分析

在當前的測序量下，2個樣本的Chao1曲線與Shannon曲線（圖1）都接近平臺期，說明增加測序數據無法再找到更多的OTU，這表明選取的樣本測序量能夠充分反映待測樣本酵母菌菌群結構的合理性及多樣性。

圖1 Shannon指數和Chao1指數稀釋曲線

兩個樣本共檢測到126 728條reads，其中子囊菌亞門（Ascomycota）32 695條，擔子菌亞門（Basidiomycota）20 150條，測序長度集中在270～300 bp之間。2個樣品共產生906個OTU，去除豐度值低于全體樣本測序總量0.001%的OTU，并去除稀有OTU，用于后續的一系列分析。OTU劃分并對分類地位鑒定的統計結果（表2）顯示，在各分類水平上東亞飛蝗體內酵母菌OTU數目均高出刺腿食蚜蠅。由vene圖（圖2）可知東亞飛蝗體內特有229個OTU，刺腿食蚜蠅體內特有259個OTU，二者共有418個OTU。

表2 OTU劃分和分類地位鑒定結果

圖2 東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅共有OTU vene圖

2.2 東亞飛蝗與刺腿食蚜蠅酵母菌Alpha多樣性分析

對2個樣本的Simpson指數、Shannon 指數、Chao1 指數、Ace指數進行Alpha多樣性及差異顯著性分析表明，東亞飛蝗的Chao1、Ace指數比刺腿食蚜蠅大，而Shannon指數、Simpson指數比刺腿食蚜蠅小（表3），說明東亞飛蝗樣本存在著稀有OTU的概率更大，而刺腿食蚜蠅樣本中群落的均勻度和豐富度更好，且優勢物種明顯。通過T假設檢驗，發現兩個樣本各多樣性指數的統計參數值（t）均小于假設檢驗顯著水平為0.01時的參考值（t0.01），表明東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅體內酵母菌多樣性差異并不顯著（表4）。

表3 樣品的Alpha多樣性指數

表4 多樣性指數差異顯著性分析

2.3 東亞飛蝗與刺腿食蚜蠅酵母菌的菌群結構分析

據OTU劃分和分類地位鑒定結果，可以獲得兩個樣本在各分類水平的具體組成（表2、表4，圖3、圖4）。相當于以不同的分辨率查看群落組成結構，比較兩個樣本在各分類水平所含有的酵母菌類群數量（表5）；東亞飛蝗體內酵母菌群共分屬于2門6綱11目12科17屬73種，刺腿食蚜蠅體內酵母菌群共分屬于2門8綱13目16科17屬88種。

各分類水平上的數目雖然大體相同，但種類和比例卻相差甚大。通過比較分析發現，在門水平上（圖3），兩個樣本的內生酵母菌主要分布在子囊菌亞門和擔子菌亞門，東亞飛蝗樣本中子囊菌亞門占比例為76.5%，而刺腿食蚜蠅中僅占22.2%，前者較后者高54.3個百分點；東亞飛蝗樣本中擔子菌亞門占比例為23.5%，而刺腿食蚜蠅中占77.8%，前者較后者低54.3個百分點。在屬水平上，兩個樣本共發現19個屬，分別為黑粉菌屬（Filobasidium）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、金擔子菌屬（Aureobasidium）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、擬威爾嗜殺酵母屬（Cyberlindnera）、梅奇酵母屬（Metschnikowia）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、Cystofilobasidium、Prototheca、Papiliotrema、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）、雙足綱酵母屬（Dipodascus）、Tetrapisispora、Kwoniella、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces）、阿卡酵母屬（Acaromyces）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamlella）、Udeniomyces。其中，兩個樣本共有的屬為前15個屬，東亞飛蝗特有的屬為擬威爾嗜殺酵母屬和擲孢酵母屬、分別占1.16%和2.91%；刺腿食蚜蠅特有的屬為雙足綱酵母屬（Dipodascus）和阿卡酵母屬、均占1.49%；東亞飛蝗體內優勢屬均為線黑粉菌屬和畢赤酵母屬、分別占44.77%和34.30%，刺腿食蚜蠅體內優勢屬也為黑粉菌屬、占43.28%；此外，東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅體內相差最大的屬為畢赤酵母屬，前者較后者高28.82個百分點。

統計發現，共有的酵母屬中，東亞飛蝗體內含量在1%以上的有6個，分別為線黑粉菌屬44.77%、畢赤酵母屬34.30%、假絲酵母屬（3.49%）、Udeniomyces3.49%、隱球酵母屬（Cryptococcus）1.74%、Papiliotrema1.74%；而刺腿食蚜蠅體內含量在1%以上的屬有11個，分別為黑粉菌屬43.28%、Udeniomyces7.46%、假絲酵母屬7.46%、梅奇酵母屬5.97%、金擔子菌屬（Aureobasidium）5.97%、畢赤酵母屬4.48%、Cystofilobasidiu4.48%、Protocheca4.48%、Papiliotrema1.49%、Kwoniella1.49%、裂殖酵母屬1.49%。此外，東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅體內未分類的真菌分別占4.4%和12.6%。

圖3 門水平菌群分類學組成和分布

圖4 屬水平菌群分類學組成和分布

表5 各分類水平的微生物類群數統計

3 結論與討論

新疆是東西方生物多樣性的過渡帶。從生態類型劃分看，是歐洲夏干帶和東亞夏濕帶之間的過渡帶。石河子地區屬于北疆地區典型的寒溫帶氣候，嚴酷的自然環境成為酵母菌進化的驅動力，因此其酵母菌多樣性存在特異性。酵母菌的生存分布受其直接和間接生存微環境特征的影響［12］，本研究中2個采樣點較近，其生境在同一農業生態系統中高度重合，且東亞飛蝗和刺腿食蚜蠅均為雜食性昆蟲［1，13］，通過Alpha多樣性分析和菌群結構分析發現刺腿食蚜蠅體內內生酵母菌多樣性略高于東亞飛蝗，但差異性并不顯著，二者的主要差別在于在于其體內特有的酵母。

統計分析發現，擬威爾嗜殺酵母和擲孢酵母只存在于東亞飛蝗體內。擲孢酵母的某些類群是人和植物的病原菌［14］，從蘋果葡萄等植株的葉片、花以及果實和其他單子葉植物中能夠分離得到，并引起植物炎癥［15］。昆蟲內共生菌不僅能調控宿主昆蟲的營養代謝和生殖代謝，還能協助昆蟲抵御生物、非生物脅迫，提高昆蟲對化學農藥的抗性及對寄主植物的適應性等［16］而擲孢酵母某些菌株具有細胞分化抵抗逆境的特點，可作為研究發育調控和抗逆機制的潛在模式生物［17］。有研究表明其抗藥性近年來也有增加趨勢，導致傳統的化學藥物對蝗蟲防治日漸式微［18-19］。在同一自然生境中，刺腿食蚜蠅體內并未發現擲孢酵母。表明蝗蟲內擲孢酵母的的抗性機制可能是導致極端環境條件下蝗蟲抗性增加的原因之一。擲孢酵母既是某些農林經濟作物的病原菌，又可能是蝗蟲抗性增加的調控因子。而野生的嗜殺酵母能夠產生一定量的嗜殺因子以抵抗病原真菌的感染而不對自身產生作用［20-21］，這在一定程度上解釋了為何蝗蟲體內存在病原真菌而不被感染。目前嗜殺酵母已廣泛應用于食品工業［22］。本研究并未對擲孢酵母對蝗蟲抗性調控的分子機理以及嗜殺因子的藥理進行深入研究，也并未見相關報道，因此通過對其進一步研究可為相關農業病蟲害的綜合性治理提供新思路。

本研究通過熒光定量原位測序技術對酵母進行聚合酶鏈式反應轉錄間隔區限制性片段多態分析（PCR-ITS—RFLP）并進行了變性凝膠電泳分析，結果表明DGGE不適用于酵母種群多樣性的定量測定，而PCR—ITS-RFLP所得結果不能完全反映樣本酵母菌群結構多樣性［23］，但高通量測序技術能夠檢測和鑒定出更多的酵母類群［24］。本研究利用26S rDNA D1/D2區域序列的高通量測序，分析2種昆蟲內生酵母菌種群結構，結果充分反映了2種具有不同生態功能昆蟲內生酵母菌多樣性的特征，為新疆豐富酵母菌資源的開發利用奠定了基礎。但本實驗所選NL1和NL2引物還檢測到枝孢屬（Cladosporium）、擬南芥屬（Arabidopsis）等其他非酵母微生物類群，針對昆蟲內生酵母高通量測序的引物選擇有待進一步研究加以改進。