液相色譜-串聯質譜法分析葡萄中農藥殘留的 基質效應評價

王嬌，齊沛沛，劉之煒，周莉，汪志威，王祥云，徐浩，狄珊珊，王強，王新全

(浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021)

農藥的使用在葡萄生產中具有防治病蟲害、提升產量和改善產品品質等重要作用，但隨之而來的農藥殘留問題也使農藥的使用備受爭議[1-2]。為了保證葡萄質量安全，靈敏、準確的農藥殘留檢測技術必不可少。目前，常用的葡萄中農藥殘留檢測技術有色譜、色譜-質譜聯用[3-5]等方法。其中，液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)具有高靈敏度、高選擇性和高通量分析的優勢，但普遍存在的基質效應卻對精準定量存在影響。為了提高分析結果的精準度，越來越多的研究致力于降低或消除基質效應[6-10]。因此，本研究針對葡萄中常用農藥(含植物生長調節劑)，評價不同農藥殘留樣品前處理技術，聯合液相色譜-串聯質譜法分析不同種類葡萄樣品時藥物的基質效應差異。選用農藥品種26種，包括殺蟲劑、三唑類殺菌劑和植物生長調劑，分別為啶蟲脒、吡蟲啉、噻蟲嗪、多菌靈、克百威、滅多威、咪鮮胺、嘧霉胺、除蟲脲、氟啶脲、苯醚甲環唑、多效唑、戊唑醇、腈菌唑、氟硅唑、丙環唑、戊菌唑、三唑醇、已唑醇、噻嗪酮、矮壯素、氯吡脲、1-萘乙酸、噻菌靈、烯酰嗎啉、炔螨特。選用色澤差異顯著的葡萄品種5種，分別為白羅莎里奧(淺)、陽光玫瑰(淺)、新雅(深)、新郁(深)及09-142(深)。分別選擇代表性檢測方法QuChERS和GB/T 20769—2008進行樣品前處理和分析，以評價不同葡萄品種的基質效應。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

LC-30A超高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；AB-SCIEX 4500三重四極桿質譜聯用儀(美國AB公司)；臺式離心機(美國Thermo公司)；旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI公司)；Filter Unit濾膜(0.22 μm)、Carb-NH2SPE柱(Agela Technologies公司)。氯化鈉、無水硫酸鎂等均為分析純；甲醇、乙腈、甲苯(色譜純，美國Merck 公司)；甲酸銨(HPLC級，美國Tedia公司)；商品化PSA、C18 (美國Agela Technologies公司)；實驗用水為超純水。26種農藥分析標準品購于上海農藥研究所或農業部環境保護科研監測所。

單標儲備液。各分析標準品分別溶解于甲醇中，各配置成一定濃度的單標儲備液。

混合標準溶液。分別準確移取一定量的單標儲備液于25 mL容量瓶中，混勻，甲醇定容。

1.2 QuChERS方法的樣品前處理過程

稱取葡萄樣品(10.00±0.05) g于50 mL離心管中，準確加入10 mL乙腈，渦旋1 min，然后加入1.5 g NaCl和4 g無水MgSO4，渦旋1 min，在7 000 r·min-1條件下離心3 min，取上清液凈化。準確移取乙腈萃取上清液1 mL加入到含有50 mg PSA、50 mg C18和0.15 g無水MgSO4離心管(2 mL)中，劇烈震蕩后渦旋1 min，在7 000 r·min-1條件下離心3 min。取0.5 mL上清液轉移至含有0.5 mL水的離心管(2 mL)中，混勻，過0.22 μm濾膜，待LC-MS/MS分析。

1.3 GB/T 20769—2008樣品前處理過程

稱取20 g葡萄樣品(精確至0.01 g)于200 mL稱量杯中，加入40 mL乙腈，用高速組織搗碎機在15 000 r·min-1，勻漿提取1 min，經抽濾后，在濾液中加入5 g氯化鈉，靜置30 min，取上清液20 mL(相當于10 g試樣量)，在40 ℃水浴中旋轉濃縮至約1 mL，待凈化。

在Carb-NH2SPE柱中，加樣前先用4 mL乙腈+甲苯(3+1)預洗柱，當液面到達無水硫酸鈉的頂部時，迅速將樣品濃縮液轉移至凈化柱上，并更換新平底燒瓶接收。再每次用2 mL乙腈+甲苯(3+1)洗滌樣液瓶3次，并將洗滌液移入柱中。在柱上加上50 mL貯液器，用25 mL乙腈+甲苯(3+1)洗脫農藥及相關化學品，合并于平底燒瓶中，并在35 ℃水浴中旋轉濃縮至約0.5 mL，將濃縮液置于氮氣吹干儀上吹干，迅速加入1 mL的甲醇+水(1+1)，混勻，經0.2 μm濾膜過濾，待LC-MS/MS分析。

1.4 LC-MS/MS分析方法

采用AB 4500液相色譜-串聯質譜儀進行葡萄中多農藥殘留的分析測定。色譜柱為Inertsil ODS-3 (75 mm×2.1 mm，2 μm)，流動相為水和甲醇(1∶9，V∶V)，其中水相和有機相中均加入5 mmol·L-1甲酸銨。流速為0. 25 mL·min-1，柱溫40 ℃，進樣量2 μL。

質譜條件。采用電噴霧離子源，多反應監測模式(MRM)，加熱溫度450 ℃，噴霧電壓為正源5 500 V，負源4 500 V。每個化合物由2對母離子-子離子對共同確定，各化合物的母離子-子離子對及相應的碰撞能量和去簇電壓經方法優化后條件見表1。

2 結果與分析

2.1 基質效應的評價方法

農藥殘留檢測過程中基質效應是影響定量準確度的關鍵因素之一，對待測物的準確定量與定性造成影響。因此，在建立分析方法之前，須對待測物進行基質效應的評估，并采取有效措施進行消除或補償，提高分析的可靠性。目前常用的基質效應的評價方法是采用基質標準曲線擬合的線性方程斜率與溶劑標準曲線線性方程斜率比(Slope ratio，SR)，可以采用SR比值或其百分數表示。若SR=100%(或1)，說明無基質效應；若SR<100%，呈基質抑制效應；若SR>100%，呈基質增強效應。當SR為80%～120%時，存在基質效應，但影響不大；當50%150%，表示基質效應強烈。

分別配制溶劑標準曲線及基質標準曲線的標準溶液。其中，溶劑標準曲線的標準溶液用甲醇-水(1∶1，V∶V)溶液配制，基質標準曲線的配制則以空白基質代替。分析過程中，分別利用QuChERS和GB/T 20769—2008處理未污染的空白葡萄樣品，完成樣品前處理過程后，在空白基質中混配不同濃度水平的農藥標準溶液，使目標化合物的質量濃度梯度為2、5、10、25、50、100和250 μg·L-1，經LC-MS/MS分析后，以色譜峰面積(Y)對質量濃度(X，μg·L-1)進行線性回歸擬合，由此計算基質效應，結果見圖1。同時以藥物在不同葡萄中基質效應的平均值計，評價2種前處理方法對葡萄基質效應的影響，結果見圖2。

2.2 基質效應評價

研究結果表明，葡萄樣品經2種前處理方法處理后均存在基質效應，并以基質抑制為主。采用不同的前處理方法時，不同葡萄品種中農藥的基質效應存在差異。

GB 20769—2008方法采用乙腈萃取，石墨化碳黑-氨基柱凈化，5種葡萄中的農藥的SR范圍為36%～174%(圖1)，平均SR為42%～174%(圖2)。基質效應較為顯著的農藥(以平均SR計)為啶蟲脒(59%)、噻蟲嗪(42%)、滅多威(49%)、矮壯素(36%)、吡蟲啉(60%)、多菌靈(60%)、多效唑(151%)和丙環唑(174%)。不同品種葡萄基質間差異較為顯著的農藥為噻蟲嗪(陽光玫瑰和新雅基質效應強)、嘧霉胺(陽光玫瑰和新郁的基質效應強)和丙環唑(白羅莎里奧和新郁的基質效應強)，其他農藥受基質效應的影響偏差可以控制在20%以內。

表1 目標化合物的LC-MS/MS參數

注：*為定量離子。

經QuChERS方法處理后，5種葡萄中農藥的SR為29%～130%(圖1)，平均SR為36%～120%(圖2)；其中基質效應較為顯著的農藥為啶蟲脒(57%)、噻蟲嗪(56%)、滅多威(36%)、矮壯素(50%)。除1-萘乙酸外，色澤對基質效應的影響偏差可以控制在15%以內。

基質效應的強度在藥物間的差異(RSD為2.3%～26.2%)顯著大于葡萄品種間的差異，且QuChERS方法中約73%農藥的基質效應小于GB/T 20769—2008中的基質效應。通常認為，GB/T 20769—2008是采用更為嚴格的凈化方法，去除的基體雜質更多，基質效應應該低于QuChERS方法。但由于GB/T 20769—2008在前處理過程中，農藥與基質均被濃縮5倍，而QuChERS方法卻將樣品稀釋了2倍，致使同一樣品經GB/T 20769—2008處理后，基質效應稍強于QuChERS方法。此外，LC-MSMS分析中的基質效應是極其復雜的多因素交互影響結果，樣品的表觀色澤度并不會直接反映基質效應的強度。

因此，基于2種前處理方法聯合LC-MS/MS分析葡萄中農藥殘留時，建議通過基質匹配標準溶液進行校正，對于受基質影響顯著的藥物，建議使用同種葡萄基質進行定量分析。

圖1 不同葡萄樣品經2種方法處理后經LC-MS/MS測定時的基質效應

圖2 2種前處理條件下農藥在葡萄中的平均基質效應

3 小結

本研究對5種葡萄樣品中26種農藥殘留分析時的基質效應進行評價，分別考察前處理方法GB/T 20769—2008和QuChERS進行前處理后，結合LC-MS/MS分析不同農藥時的基質效應差異。結果表明，QuChERS方法中約73%農藥的基質效應小于GB/T 20769—2008中的基質效應；基質效應的強度在農藥種類間的差異顯著大于葡萄品種間的差異。LC-MS/MS分析中的基質效應是極其復雜的多因素交互影響結果。因此，在分析葡萄樣品中農藥殘留分析時需通過基質匹配標準溶液進行校正，對于受基質影響顯著的藥物建議使用同種葡萄基質進行定量分析。