苦蘵總黃酮的提取及含量測定

薛潔，廖昕玥，俞春娜，薛婧萍，馮尚國，王慧中，展曉日

(浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室 杭州師范大學生命與環境科學學院，浙江 杭州 310036)

苦蘵(PhysalisangulataL.)是茄科酸漿屬一年生草本植物，是一種民間常用的藥用植物，其根、莖、葉、宿萼、果實均可用藥。其化學成分主要為甾體類(酸漿苦味素類和睡茄內酯類)、黃酮類、有機酸類、多糖類等化合物[1]，具有清熱，利尿，解毒，消腫之功。現代藥理研究發現，苦蘵具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調節、抗炎、抗菌等藥理活性[2-6]。黃酮類化合物作為其主要有效成分之一，具有保護心血管、抗肝臟毒、抗炎、抗菌、抗病毒等作用[7]。但目前苦蘵化學成分及質量標準研究多集中于甾體類化合物，對苦蘵中黃酮類化合物研究相對較少。本研究針對苦蘵中總黃酮的提取及含量測定方法進行了研究，為更加有效地開發和利用苦蘵提供一定的科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Evolution 201 紫外分光光度計(美國Thermo公司)；MS104S電子天平(瑞士梅特勒公司)；DHG9203A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；KQ5200DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；5418R離心機(德國Eppendorf公司)等。

1.2 試劑

蘆丁對照品購自中國食品藥品檢定研究院(批號100080-201409)；乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉等均為分析純；水為蒸餾水。

苦蘵果實采自不同產地，經杭州師范大學生命與環境科學學院馮尚國老師鑒定為茄科酸漿屬苦蘵的果實。將其宿萼剝下，40 ℃烘干48 h，粉碎，過40目(孔徑0.42 mm)篩，備用。

1.3 溶液的制備

1.3.1 供試品

取苦蘵宿萼粉末約0.02 g，精密稱定，于 2 mL離心管中，加入1.2 mL體積分數為30%的乙醇水溶液，超聲提取60 min。12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，備用。

1.3.2 對照品

取蘆丁適量，精密稱定，于容量瓶中，30%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.1 mg·mL-1的對照品儲備溶液。

2 結果與分析

2.1 方法學的考察

2.1.1 線性關系

分別精密吸取對照品儲備液溶液1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加10%硝酸鋁0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加1 mol·L-1的氫氧化鈉4 mL，再加30%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min，以空白對照液調零，在波長505 nm處測定吸光度，以吸光度(Y)為縱坐標，以濃度(X)為橫坐標，進行線性回歸，得蘆丁標準曲線。其線性回歸方程：Y=1.009X-0.004，r=0.999 5，說明0.1～0.5 mg·mL-1，線性關系良好。

2.1.2 精密度

精密吸取對照品儲備液3 mL，共6份。按2.1.1節方法操作，測定吸光度。總黃酮含量的相對標準偏差為1.38%，說明儀器精密度良好。

2.1.3 穩定性

精密吸取對照品儲備液3 mL，按2.1.1節方法操作。分別放置0、15、30、45、60 min，測定其吸光度。總黃酮含量的相對標準偏差為0.93%，說明在60 min內穩定性良好。

2.1.4 重復性

取同一批苦蘵宿萼粉末6份，按1.3.1節樣品溶液制備方法進行制備，按2.1.1節方法操作，測定吸光度。總黃酮含量的相對標準偏差為0.99%，說明該方法重復性良好。

通過分析，對于細菌總數最優組合為A3B3C3；對于揮發性鹽基氮最優組合為A3B3C3；對于pH值最優組合是A1B1C3。綜合評定，確定最優組合為A3B3C3，即乳酸鏈球菌素0.50%，茶多酚0.30%，植酸0.20%。

2.1.5 加樣回收率

取已知含量的同一批苦蘵宿萼粉末0.02 g，6份，精密稱定，精密加入對照品儲備液1 mL，按1.3.1節樣品溶液制備方法進行制備。按2.1.1節方法操作，測量吸光值，計算加樣回收率。

總黃酮的平均回收率為98.0%，相對標準偏差為1.00%，說明加樣回收率符合要求。

2.2 苦蘵總黃酮提取工藝的優化

2.2.1 單因素試驗

分別考察乙醇體積分數、提取時間、料液比對苦蘵總黃酮提取的影響。

乙醇體積分數對苦蘵總黃酮提取的影響。按料液比1∶50加入體積分數分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇超聲提取60 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，測定樣品總黃酮含量。

由圖1可知，隨著乙醇體積分數的不斷增加，總黃酮得率先增加后減少。當乙醇體積分數為40%時，總黃酮得率最高。

圖1 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響

提取時間對苦蘵總黃酮提取的影響。按料液比1∶50，加入體積分數為40%的乙醇溶液，分別超聲提取15、30、45、60、75 min，測定樣品總黃酮含量。

由圖2可知，隨著提取時間的增加，總黃酮得率先增加后減少。當提取時間增加到60 min時，總黃酮得率最高。

圖2 提取時間對總黃酮得率的影響

料液比對苦蘵總黃酮提取的影響。分別按1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70的料液比(m/V)用體積分數為40%的乙醇超聲提取60 min，測定樣品總黃酮含量。

由圖3可知，隨著料液比的不斷增大，總黃酮得率逐漸增加。當料液比為1∶50時，總黃酮得率最高。

圖3 料液比對總黃酮得率的影響

2.2.2 正交試驗

根據單因素實驗結果，選用L9(34)因素水平表進行正交試驗。1～3水平，乙醇體積分數(A)分別為30%、40%和50%，提取時間(B)分別為30、45和60 min，料液比(m/V，C)分別為1∶40、1∶50和1∶60。有關結果見表1。

表1 多因素對總黃酮含量的影響

由表1分析可知：不同因素對總黃酮提取效果的影響順序為A>C>B，即乙醇體積分數>料液比>提取時間。苦蘵總黃酮的最佳提取條件為A1B3C3，即30% 乙醇溶液，料液比1∶60，提取60 min。

2.3 不同產地苦蘵中總黃酮的含量

取不同產地苦蘵宿萼粉末，按2.1.1節方法制備供試品溶液，按1.3.2節加入5%亞硝酸鈉0.4 mL在波長505 nm處測定吸光度，計算不同產地苦蘵中總黃酮的含量(表2)。

表2 不同產地苦蘵的總黃酮含量

3 小結

結合單因素試驗和正交試驗，比較了乙醇體積分數、料液比、提取時間3個因素對苦蘵總黃酮提取率的影響，確定了苦蘵總黃酮的最佳提取工藝為30%乙醇溶液，料液比1∶60，提取60 min。并采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定了苦蘵中總黃酮的含量，該方法操作簡便、快速、準確，為苦蘵的進一步開發利用提供了一種可行的質量控制方法。