美人蕉快繁及莖尖脫毒體系的建立

陳志，汪一婷，呂永平，牟豪杰

(浙江省農業科學院 病毒學與生物技術研究所，浙江 杭州 310021)

美人蕉(Cannaindica) 原產美洲，別名蘭蕉、曇華，植株俊秀挺拔、花大色艷、花色豐富、花期長，是一種非常優良的園林和景觀綠化植物，且開花時正值我國南方炎熱少花的季節，可大大豐富園林綠化中的色彩。同時，美人蕉具有較強的凈化環境和抗污染的能力，對氟化物、二氧化硫等有毒氣體的吸收能力較強，是一種非常理想的多用途花卉。美人蕉通常利用地下根莖進行分株繁殖，但會導致母本攜帶病毒不斷積累并傳播給后代，迄今已在美人蕉屬植物發現的病毒包括美人蕉黃色條紋病毒、西紅柿不育病毒[1]、美人蕉黃斑駁病毒[2-3]、黃瓜花葉病毒[4-5]、菜豆黃花葉病毒[4]等，引起植株葉片產生花斑或植株壞死，極大降低美人蕉的觀賞性。

關于美人蕉組織培養的報道中，劉麗萍等[6]以帶芽苞根莖為外植體進行水生美人蕉組培快繁技術研究；王丹等[7]以大花美人蕉根莖莖尖為外植體進行組織培養技術研究中指出，美人蕉增殖效率低下，最高為1.67。本研究旨在建立美人蕉高效組培快繁體系，同時進行美人蕉脫毒種苗生產研究，為美人蕉脫毒苗推廣奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本單位引進并種植保存的7個國外美人蕉品種。

1.2 方法

1.2.1 美人蕉無菌材料獲得

選取美人蕉地下帶芽的根莖作為起始材料，將根莖表面根切除，洗凈附著物，將芽從根莖上切下，剝除外部1～2 層芽鱗，表面處理光滑后即可進行表面消毒。用洗潔精溶液振蕩清洗20 min，然后用流水沖洗干凈外植體表面殘留物，在超凈工作臺上將洗凈的外植體轉移至無菌錐形瓶中，浸入75%酒精60 s，再用有效氯濃度為1%的NaClO溶液浸泡10～15 min，然后用無菌水清洗經過消毒處理的外植體4～5次，將外植體接種到MS基本培養基中培養，光照強度(40±2)μmol·m-2·s-1，光周期為16 h。

1.2.2 美人蕉莖尖培養

將株高2 cm左右美人蕉無菌萌發芽轉移至放有無菌濾紙的接種盤中，在解剖鏡下將芽鱗逐層剝離，最后切下頂端0.2～0.5 mm長的莖尖部分，將其接種到MS+6-BA(0.10～0.50)mg·L-1+NAA(0.05～0.20)mg·L-1+脯氨酸(50～200)mg·L-1+蔗糖30 g·L-1的培養基中，(24±2)℃下暗培養7～10 d，然后將材料移至同溫下光培養(12～14)h·d-1，光照強度為(40±2)μmol·m-2·s-1，至莖尖培養材料長至1～2 cm后進行不定芽誘導及增殖。

1.2.3 美人蕉不定芽誘導及增殖

在莖尖培養獲得的不定芽基部輕劃造成一些傷口，接種于不定芽誘導培養基中進行不定芽的誘導及增殖，將每個芽作為1個株系進行編號，方便后期病毒檢測。不定芽誘導及增殖培養基為MS+6-BA(6.0～10.0)mg·L-1+CaCl2(500～800)mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，培養溫度(24±2)℃，光照時間為(12～14)h·d-1，光照強度為(40±2)μmol·m-2·s-1。

1.2.4 美人蕉病毒檢測及脫毒材料擴繁

每個株系美人蕉增殖良好材料剪取新鮮葉片100 mg左右進行病毒檢測，本研究檢測病毒包括黃瓜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和西紅柿不育病毒共3種，采用雙抗體夾心ELISA(DAS)檢測法進行檢測，所有ELISA試劑盒購于ADGEN公司，操作流程詳見說明書。對于未攜帶檢測病毒的株系，按照“1.2.3”方法進行不定芽增殖擴繁。

1.2.5 美人蕉生根誘導及移栽馴化

叢生不定芽從基部將生長至3～5 cm高的不定芽單個分開，接入生根培養基中進行誘導，生根培養基為MS+IBA 0.2 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，培養溫度(24±2)℃，光照時間為(12～14)h·d-1，光照強度為(40±2)μmol·m-2·s-1。

不定芽基部長出2～3條1～2 cm的不定根后移至溫室，散射光下培養5 d后打開瓶蓋，再培養1～2 d，將生根苗表面瓊脂洗干凈，栽入基質中，相對濕度90%以上培養15 d，然后在溫室中正常培養。

2 結果與分析

2.1 美人快繁體系建立

美人蕉快繁體系建立情況如圖1所示。試驗中發現，美人蕉無菌材料極易成活、生根，而且在添加有植物生長素或低濃度的6-BA的培養基中，美人蕉也極易生長出不定根，從而導致增殖系數極低，難以達到產業要求。本研究發現，作為細胞分裂活性更強的細胞分裂素噻苯隆(TDZ)對美人蕉不定芽增殖效果不佳，即使在添加低濃度TDZ的培養基中，不定芽叢生、矮化、玻璃化現象仍很明顯，能獲得的有效不定芽數量有限，因此增殖效率提升有限。王丹等[7]研究報告中也得出與本研究相同結果。研究還發現，在增殖培養基中增加Ca2+可有效抑制不定根的數量。當Ca2+離子濃度達到800 mg·L-1時，基本可抑制增殖過程中不定根的形成，不定芽增殖效率可提高至2.8左右，且長勢正常。劉臻曄[8]的研究結果顯示，Ca2+離子的加入對馬鈴薯試管苗生根無影響或有部分促進效果，與本研究結果相反，可能是由于不同植物造成的。

a為根莖外植體；b為不定芽增殖； c為不定芽生根；d為組培苗移栽圖1 美人蕉再生體系的建立

2.2 美人蕉莖尖培養

莖尖大小對培養的成活率影響很大。根據賢武等[9]的研究結果，對2 mm長的莖尖進行培養，莖尖成活率最低為12.5%，最高為65.0%。Ramgareeb等[10]研究結果也顯示，當莖尖長度介于1～2 mm時，成活率為79.2%；若小于1 mm，則成活率下降至46.0%；若培養莖尖尺寸更小，成活率將更低。但據Gosalvez-Bernal等[11]對康乃馨莖尖中病毒分布的研究結果顯示，僅在莖尖頂端分生組織0.5 mm以上區域內未檢測到病毒粒子的存在，因此為了避免因脫毒不徹底造成的材料浪費，本研究采用培養長度低于0.5 mm(0.2～0.5 mm)的美人蕉莖尖培養。

研究對已建立無菌體系的7個美人蕉進行莖尖剝離和培養，每個品種剝離30個莖尖，最終獲得71個成活材料。表1中，成活率為成活株系與起始莖尖數量的比值，莖尖培養成活率最高約為53.3%，最低約為13.3%，平均成活率約33.8%，基本與賢武等[12]研究結果符合。莖尖培養過程如圖2所示。

2.3 莖尖獲得材料病毒檢測情況

對本研究獲得的7個美人蕉品種共71個莖尖再生株系進行黃瓜花葉病毒、菜豆黃花葉病毒和西紅柿不育病毒檢測。對第1次檢測結果中未攜帶3種檢測病毒的材料在接下來連續2個培養周期中重復檢測，將最終3次檢測均未攜帶檢測病毒的株系確定為脫毒植株。表1中，無毒植株得率為無毒株系與成活株系的比值，共獲得40個未攜帶3種檢測病毒株系，最高脫毒率為100.0%，最低脫毒率為30.8%，平均脫毒植株得率為56.3%。

表1 美人蕉莖尖培養及病毒檢測結果

圖2 美人蕉莖尖剝離及培養的情況

檢測株系中，攜帶TAV病毒植株最少，僅有2個品種4個株系攜帶；攜帶BYMV病毒植株系最多，有6個品種27個株系；攜帶CMV病毒植株系有4個品種11個株系。另外，檢測結果還顯示，美人蕉存在復合侵染的情況。本研究中，攜帶2種檢測病毒的有6株系，攜帶所有檢測病毒的植株有3株系。

3 討論

已有研究結果表明，美人蕉快繁體系中極低的不定芽增殖效率在很大程度上阻礙了利用植物組培技術對美人蕉品種的推廣應用，本研究前期也遇到這個問題，因此今后提高有效不定芽增殖效率是美人蕉快繁體系建立和優化的重點方向。通過在增殖培養基中加入5～8 mmol·L-1的Ca2+后，有效抑制了增殖過程中不定根的形成，使不定芽增殖效率提高到2.8左右，而且對不定芽生長及后期生根誘導無不良影響，這在美人蕉組培報道中尚屬首次。

本研究的另一重點是美人蕉脫毒材料的獲得。在美人蕉莖尖培養階段，并未以莖尖成活率為重點，而是以脫毒效率為重點，因此剝離莖尖尺寸基本小于0.5 mm，雖然平均成活率約為33.8%，但種苗脫毒率超過平均56.3%。賢武等[12]在甘蔗莖尖培養研究中發現，1～2 mm甘蔗莖尖培養成活率達到60%～80%，遠高于本研究結果，但其并未進行病毒檢測相關方面工作，故脫毒效率未知。結合前人研究結果，本研究認為，對于植物莖尖培養而言，其主要目的就是獲得脫毒植株，因此脫毒效率是首先必須要考慮的。

綜上所述，本研究建立美人蕉快繁技術體系增殖效率達到2.8，莖尖培養體系中莖尖成活率達到33.8%，脫毒株系得率約56.3%，基本達到美人蕉脫毒種苗產業化生產需求。