市售農殘速測儀對青菜中毒死蜱和三唑磷的檢測評價

汪志威，沈玉姣,2，徐浩，周思齊，徐霞紅，齊沛沛，王祥云，狄珊珊，王新全*

(1.省部共建國家重點實驗室培育基地“浙江省植物有害生物防控重點實驗室”農業農村部農藥殘留檢測重點實驗室 浙江省農業科學院農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江師范大學 行知學院，浙江 金華 321004)

果蔬中的農藥殘留問題一直受到群眾的普遍關注，目前浙江省主要的生產基地、批發市場、農貿市場和超市等基層食品安全質監部門均已配備了農殘速測儀，主要用于對蔬菜中有機磷與氨基甲酸酯農藥的快速檢測。它基于酶抑制率法的原理，具有前處理簡單、檢測時間短、不需昂貴的儀器、易于掌握等優點[1-3]。在上世紀80年農殘速測儀得到了快速的發展，是目前研究最多，相對成熟，且在全省范圍內使用最廣泛的一種農藥快速檢測技術[4]。

毒死蜱和三唑磷是典型的有機磷農藥，屬于農殘速測儀篩查范圍[5]。過去在農業生產上也曾被推薦和廣泛使用，但隨著新型高效低毒農藥的開發和農業安全生產要求的不斷提高，自2016年12月31日起，依據農業部2 032號公告毒死蜱和三唑磷被禁止在蔬菜上使用。

目前針對農殘速測儀的方法標準主要有GB/T 5009.199—2003 蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量的快速檢測，NY/T 448—2001蔬菜上有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測方法，以及國家食品藥品監督管理總局公布的食品快速檢測方法《蔬菜中敵百蟲、丙溴磷、滅多威、克百威、敵敵畏殘留的快速檢測》(KJ201710)等，然而上述標準和方法均未規定對新禁用農藥毒死蜱和三唑磷的檢測靈敏度范圍。目前市場上使用的農殘速測儀產品眾多，涉及品牌包括博納，復訊，瑞鑫，托普，天邁，藤蔓等13余個品牌，配套的酶試劑來源不同且具有明顯的性能差異，因而評價市售速測儀產品對毒死蜱和三唑磷靈敏度，可以為更新和制定相關速測標準提供重要數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和設備

毒死蜱和三唑磷標準品為購自農業農村部環境保護科研監測所(天津)的農藥標準品，濃度為1 000 mg·L-1。青菜購自杭州東新農貿市場，經試劑盒檢測結果為陰性，且抑制率均≤10%。市售的9種農殘速測儀按照調研順序排列，分別編為A、B、C、D、E、F、G、H、I，相應的酶試劑生產批次在2017年1—7月。青菜樣品前處理QuEChERS方法凈化材料包括乙酸鈉，無水硫酸鎂，石墨化炭黑，PSA和C18購自天津艾杰爾公司。氣相色譜-火焰光度檢測器(GC-FPD)，型號為TRACE GC Ultra，由美國Thermo Electron Corpration公司生產。

1.2 方法

樣品前處理。市售青菜樣品剪成1 cm× 1 cm，稱取2 g菜樣于50 mL離心管中若干份，按需要添加不同濃度梯度的毒死蜱或三唑磷標準品溶液，靜置30 min。加入10 mL緩沖液后，振蕩提取5 min。

1.2.1 農殘快速檢測

緩沖溶液、顯色劑、酶試劑和底物的配置。試劑的配置嚴格按照各廠家說明書執行，緩沖鹽溶液的配置分為單包裝直接溶解和2個包裝混合溶解，酶試劑的配置分為5 mL和3.1 mL緩沖鹽溶液2種類型。

樣品(對照)制備。取上清液(對照為2.5 mL緩沖鹽空白溶液)2.5 mL于10 mL離心管中，加入100 μL酶試劑，100 μL顯色劑，混勻后在37 ℃水浴中靜置10 min，然后加入100 μL底物后，轉入比色皿上農殘速測儀分析[6]。

1.2.2 色譜檢測

分別將青菜和對應緩沖提取液分成2份樣品，分別按照下述步驟前處理。

將青菜樣品適當瀝干后轉入50 mL離心管中，加入10 mL乙腈溶液，勻漿1 min，加入4 g 無水硫酸鈉和1 g氯化鈉，渦旋1 min，7 000 r·min-1離心后取上清液5 mL，氮吹至少于1 mL，用乙腈定容至1 mL，加入40 mg PSA和40 mg C18，充分混勻后7 000 r·min-1離心3 min，取上清液過0.22 μm有機膜后上機GC-FPD檢測。

從提取液中取5 mL置入50 mL離心管，加入10 mL乙腈溶液，振蕩1 min，加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉充分混合。離心3 min后取上清液2 mL，加入40 mg PSA和40 mg C18，充分混勻后7 000 r·min-1離心3 min，取上清液過0.22 μm有機膜后上機GC-FPD檢測。

1.3 處理設計

1.3.1 青菜樣品中靈敏度試驗

按照速測標準GB/T 5009.199—2003制備72份2 g空白青菜，分別添加6組標樣，添加水平分別為0.1、0.5和5 mg·kg-1毒死蜱，0.1、0.5和5 mg·kg-1三唑磷，重復12組，其中3組平行樣通過色譜檢測，另外9組平行樣品分別通過農殘速測儀A、B、C、D、E、F、G、H、I及配套試劑盒上機檢測。

1.3.2 緩沖鹽提取液靈敏度試驗

在靈敏度測試時使用各個品牌的農殘速測試劑盒進行測試，同時為減少因檢測儀器帶來的系統誤差，本試驗使用農殘速測儀A對各品牌試劑盒靈敏度進行評價。

首先，配置緩沖鹽溶液2 L作為提取液，其次，使用提取液分別配置濃度梯度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、1、2、3、4和5 mg·L-1毒死蜱標準溶液，以及0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4和5 mg·L-1三唑磷標準溶液各100 mL。在提取液靈敏度測試時根據抑制率結果適當調整測試濃度，通常以2倍濃度調增或調減。

1.4 靈敏度

采用毒死蜱或三唑磷標準品，加入蔬菜樣品中靜置30 min，因抑制率與農藥殘留含量成正相關，且抑制率≥50%為陽性。測定某種農藥靈敏度即檢出限，用此農藥標準品添加，使得抑制率為50%，即為此種農藥檢出限，在試驗時添加后剛好測定抑制率為50%難以操作，因此添加使得抑制率接近且大于50%所對應的添加濃度即為靈敏度[7-8]。

2 結果與分析

基于酶抑制率法的農殘速測儀，其原理是利用有機磷與氨基甲酸酯類農藥可特異性地抑制昆蟲中樞和周圍神經系統中乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的活性，破壞神經的正常傳導，是昆蟲中毒致死這一毒理學原理[9-10]。將AChE與樣品反應，如果試樣中沒有農藥殘留或者殘留量極少，AChE的活性就不被抑制；反之，如果農藥殘留量比較高，AChE的活性就會被農藥所抑制[11-12]，而抑制率與農藥的濃度呈正相關。

2.1 毒死蜱和三唑磷基于色譜分析的添加回收率

為驗證色譜檢測方法能有效應用于緩沖鹽溶液和青菜中毒死蜱和三唑磷的殘留檢測，本試驗分別往2 g空白青菜和5 mL緩沖鹽溶液A中添加毒死蜱和三唑磷混合標準溶液，農藥添加水平分別為青菜0.05和0.25 mg·kg-1，緩沖鹽溶液0.1和0.5 mg·L-1。結果如表1所示，青菜的添加回收率86.1%～108.0%，相對標準偏差0.1%～0.6%，緩沖鹽溶液中農藥的回收率80.1%～84.7%，相對標準偏差0.2%～0.9%。

表1 色譜分析方法對青菜和緩沖鹽溶液中的 添加回收率

2.2 農殘速測儀在添加毒死蜱和三唑磷青菜樣品中的篩查結果

本試驗在青菜樣品中分別添加毒死蜱和三唑磷，共添加3個濃度水平0.1、0.5和5 mg·kg-1的毒死蜱。速測結果顯示(表2)，在0.1和0.5 mg·kg-1添加水平時，9種速測儀對青菜樣品中的毒死蜱和三唑磷均為陰性；在5 mg·kg-1毒死蜱添加水平下的青菜，A和B兩種速測儀檢出陽性，其余均為陰性；在5 mg·kg-1三唑磷的添加水平下，僅B、C和E篩查結果為陽性，且為弱陽性，其余均為陰性。

為驗證青菜樣品添加毒死蜱和三唑磷后的真實濃度，防止揮發等因素引起殘留量的偏差，本試驗對與速測儀檢測對照的3組樣品進行殘留分析。結果如表2所示，色譜方法檢測青菜中殘留實測值分別為，毒死蜱在三檔添加水平下分別為0.093、0.49和4.9 mg·kg-1，三唑磷分別為0.088、0.45和4.7 mg·kg-1，實測值與添加值結果基本一致。

表2 9種速測儀對青菜提取液中添加毒死蜱和三唑磷后的抑制結果

注：+表示抑制率≥50%，檢測結果為陽性，-表示抑制率<50%，檢測結果為陰性。

根據食品安全國家標準GB 2763—2016，按蔬菜種類劃分青菜屬于普通白菜，其毒死蜱的最大殘留限量(MRL)為0.1 mg·kg-1；上述標準中未限定普通白菜中三唑磷的MRL，但規定結球甘藍和節瓜中三唑磷的MRL為0.1 mg·kg-1；因而本試驗中設定青菜中毒死蜱和三唑磷的MRL均為0.1 mg·kg-1。按9種速測儀檢測結果顯示，在0.1和0.5 mg·kg-1(5倍MRL)添加水平的毒死蜱和三唑磷，9種市售速測儀均無法檢出陽性；即使在5 mg·kg-1的添加水平下，僅有A和B能檢出毒死蜱的陽性，三唑磷的陽性略優于毒死蜱，有3種速測儀能檢出陽性，但仍有6種速測儀無法檢出這一添加濃度的三唑磷，說明農殘速測儀在篩查蔬菜中毒死蜱和三唑磷的靈敏度有待提升。

2.3 農殘速測儀對緩沖鹽溶液中添加三唑磷和毒死蜱的靈敏度

9種市售農殘速測儀對添加2種有機磷農藥緩沖鹽溶液的靈敏度檢測時，分別以毒死蜱0.08和2.00 mg·L-1、三唑磷以0.30和0.50 mg·L-1的基準濃度調整測試濃度。如表3所示，按照靈敏度的定義可得9種速測儀對緩沖鹽溶液中毒死蜱的靈敏度分別為0.06 mg·L-1(速測儀A)，0.06 mg·L-1(速測儀B)，>5 mg·L-1(速測儀C)，2.5 mg·L-1(速測儀D)，>5 mg·L-1(速測儀E)，>5 mg·L-1(速測儀F)，5 mg·L-1(速測儀G)，5 mg·L-1(速測儀H)，1.0 mg·L-1(速測儀I)。從9種速測儀對毒死蜱緩沖鹽溶液測試結果看，A、B屬于靈敏度高的第一梯隊，在0.06 mg·L-1附近，I、D、G和H屬于靈敏度第二梯隊，在1～5 mg·L-1，C、E和F靈敏度較差，已經>5 mg·L-1。

各速測儀對緩沖鹽溶液三唑磷的靈敏度，A為0.20 mg·L-1，B為0.15 mg·L-1，C為0.15 mg·L-1，D為0.20 mg·L-1，E為0.15 mg·L-1，F為0.20 mg·L-1，G為0.30 mg·L-1，H為0.30 mg·L-1，I為2.50 mg·L-1·L-1。如表4所示，從9種速測儀對三唑磷緩沖鹽溶液測試結果看，A、B、C、D、E、F、G和H靈敏度較高，在0.15～0.30 mg·L-1，I靈敏度較差在2.5 mg·L-1左右。

表3 市售農殘速測試劑盒對毒死蜱不同緩沖鹽溶液的抑制率結果

表4 市售農殘速測試劑盒對三唑磷緩沖鹽溶液的抑制率結果

2.4 靈敏度評價方式的差異

目前對于農殘速測儀靈敏度的評價存在提取液和蔬菜中農殘含量2種方式，分別對應mg·L-1和mg·kg-1兩個濃度。如根據NY/T 488—2001蔬菜上有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測方法規定，最低檢出濃度分為溶液和蔬菜2種類型。GB/T 5009.199—2003和食品快速檢測方法(KJ 201710)規定的檢測限為質量濃度mg·kg-1。本試驗中對于蔬菜和提取溶液靈敏度的差異來自兩部分。首先是單位的差異，由于在提取時按照2 g蔬菜樣品對應10 mL提取液，假設提取完全，則提取液靈敏度(mg·L-1)× 10 mL/2 g≈蔬菜靈敏度(mg·kg-1)，即0.06 mg·L-1毒死蜱的提取液靈敏度對應蔬菜的靈敏度為0.3 mg·kg-1，但實際上由于存在提取效率的問題，蔬菜的實際靈敏度遠大于5倍。

其次，快速檢測方法的提取液體系是緩沖鹽溶液-蔬菜中農藥殘留。由于大多數有機磷和氨基甲酸酯類農藥是脂溶性的，難以溶于水，故而其提取效率較低[13-14]。根據PPDB的農藥性質數據庫(http://sitem.herts.ac.uk/aeru/ppdb/en/atoz.htm)中可查到，在20 ℃條件下，毒死蜱在純水中的溶解度為1.05 mg·L-1，三唑磷在純水中的溶解度為35 mg·L-1。加緩沖鹽后通常還會降低農藥的溶解度。本試驗在2 g青菜樣品中分別添加0.5 mg·kg-1毒死蜱和三唑磷，在10 mL緩沖鹽溶液提取后，分別對提取液和提取后的青菜樣品進行色譜檢測，結果發現，添加毒死蜱在兩相中的殘留濃度分別為0.009和0.39 mg·L-1，三唑磷的分布分別為0.010和0.31 mg·kg-1，經計算僅有10.3%的毒死蜱和13.9%的三唑磷能被緩沖鹽溶液提取，這就解釋了8種速測儀A、B、C、D、E、F、G和H對提取液靈敏度均在0.15～0.3 mg·L-1，但對于5 mg·kg-1三唑磷加標的青菜樣品，沒有顯示為強陽性卻反而為陰性的原因。由于緩沖鹽溶液對青菜的提取效率太低，但需要說明的是，通常蔬菜中的農藥殘留是在助劑溶解的農藥產品施藥后殘留的，這些助劑和農藥共同殘留在蔬菜表面，可能有助于緩沖溶液對農藥的提取。另外不同蔬菜種類的葉片、葉片的剪碎程度、提取時間和提取溫度等因素都對速測法的靈敏度存在影響，但不可否認的是，利用緩沖鹽溶液提取農藥的能力太弱，不利于速測法在對蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥的檢測。

3 小結

目前市售的9種速測儀產品均不滿足對青菜中添加0.1和0.5 mg·kg-1毒死蜱和三唑磷的快速檢測，對于5 mg·kg-1毒死蜱的靈敏度僅有農殘速測儀A和B能滿足檢測需要，5 mg·kg-1三唑磷的靈敏度僅有速測儀B、C、E能滿足需要。9種速測儀在毒死蜱緩沖鹽提取液的靈敏度差異明顯，分為0.06 mg·L-1，1～5 mg·L-1和>5 mg·L-1三檔，在三唑磷緩沖鹽溶液的靈敏度較為集中，8種試劑盒的靈敏度均在0.15～0.3 mg·L-1，1種試劑盒靈敏度為2.5 mg·L-1。農殘速測儀利用緩沖鹽溶液提取效率僅為10.3%～13.9%，雖然受多種因素影響，但提取效率的事實無法改變。未來對于速測方法的改良，應從添加洗滌劑或改變提取溶劑等方式以提高農藥提取效率，從而優化速測方法在蔬菜中農藥殘留的檢測。