飼養方式對蘇尼特羊脂肪組織中脂肪代謝相關基因表達量的影響

楊 蕾，王柏輝，羅玉龍，王 宇，蘇 琳，趙麗華，靳 燁*

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

脂肪具有儲存甘油三酯并釋放脂肪酸的作用，被認為是改善羊肉品質和影響羊肉風味的重要物質。在脂肪組織中硬脂酰輔酶A去飽和酶（stearoyl-CoA desaturase，SCD）、脂肪酸脫氫酶Ⅰ（Δ5-fatty acid desaturases，FADS1）、脂肪酸脫氫酶Ⅱ（Δ6-fatty acid desaturases，FADS2）、脂肪酸延長酶（elongase of very long chain fatty acid 5，Elove5）、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）、肉堿棕櫚酰轉移酶Ⅰ（carnitine palmitoyltransferase I，CPT1）、脂肪酸結合蛋白酶（fatty acid-binding protein，FABP4）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ）是影響脂肪合成和分解的關鍵酶。近年來，大量的研究表明，調控飼養方式對脂肪酸組成和脂肪代謝相關基因的表達有一定影響[1-3]。有研究結果表明不同飼養方式對羊肉中LPL、ACC、FABP4、CPT1和SCD基因表達量以及脂肪酸組成和含量均有影響[4-5]。Meadus等[6]發現在日糧中添加共軛亞油酸可以影響PPARγ基因的表達，從而促進肌內脂肪的沉積。

蘇尼特羊作為內蒙古獨特的優良羊種，原產于錫林郭勒盟，含蛋白高且膻味輕，并且富含人體所需的各種氨基酸和脂肪酸，具有較高的營養價值[7]。羅玉龍[8]、郭月英[9]、蘇琳[10]等主要對蘇尼特羊肉中風味物質、生長特性相關基因和肌纖維的種類分布等方面進行研究，但對于影響蘇尼特羊肉中營養成分的因素，特別是對肉中不飽和脂肪酸種類與含量的研究相對較少。本實驗采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法研究飼養方式對脂肪代謝相關基因mRNA表達量的影響，同時分析不同脂肪組織中脂肪代謝基因表達量的差異性，以期從分子生物學的角度解釋放牧和圈養兩種飼養方式下蘇尼特羊脂肪組織中脂肪和脂肪酸的沉積機理，為改善圈養條件下蘇尼特羊肉品質和風味提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

隨機從內蒙古巴彥淖爾市五原縣巴美肉羊種園區選取放牧和圈養條件下12 月齡的蘇尼特羊各10 只（公母各5 只），宰前絕食20 h，屠宰后，取肌內脂肪、尾脂和腎脂各約10 g，于液氮中保存，并轉移到實驗室置于-80 ℃冰箱下保藏待用。

氯仿、異丙醇、無水乙醇（均為分析純）、RNase-free水北京天根生物技術有限公司；瓊脂粉 天津市風船化學試劑科技有限公司；核酸染料 北京百泰克生物技術有限公司；焦碳酸二乙酯 Intrivogen公司；RNAiso Plus、6×loading buffer、Marker DL2000、Premix Taq?Version2.0、PremeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTM大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

ZHJH-C1112C超凈臺 上海智城分析儀器制造有限公司；5430R低溫臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；BG-power5000型穩壓穩流電泳儀 北京百晶生物科技有限公司；水平電泳槽、凝膠成像分析儀、CFX96TMReal-Time PCR儀 美國Bio-Rad公司；普通PCR儀美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 引物與探針設計與合成

SCD、FADS1、FADS2、LPL、ACC、CPT1、PPARγ、Elove5、FABP4由上海生工生物工程有限公司設計并合成，β-actin作為管家基因（表1）。

表 1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.3.2 總RNA提取與反轉錄

稱取50～100 mg的樣品放入經液氮冷卻的研缽中，并不斷加入液氮研磨樣品至細粉末狀用于RNA提取，提取參照參考文獻[11]，得到RNA后使用質量分數1%的瓊脂糖膠點樣并電泳檢測提取的總RNA的質量與質量濃度。

將所有RNA樣品稀釋為統一質量濃度500 ng/μL。使用反轉錄試劑盒（PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）兩步法將RNA樣品反轉錄為cDNA，反轉錄過程參照參考文獻[11]，反轉錄后得到的cDNA質量濃度默認為50 ng/L，在-20 ℃冰箱內保存備用。

1.3.3 實時熒光定量PCR

本實驗按照CFX96TMReal-Time PCR Detection System的二步法進行操作。以上述所合成的cDNA為模板，使用SYBR?Premix Ex TaqTMII（TLi RNaseH Plus）試劑盒進行實時熒光定量PCR擴增[12]。

熒光實時定量PCR體系（25.0 μL）：SYBR?Premix Ex TaqTMII（TLi RNaseH Plus） 12.5 μL、引物F 1.0 μL、引物R 1.0 μL、cDNA模板2.0 μL、RNase Free dH2O 8.5 μL。

實時熒光定量PCR條件：預變性95 ℃、30 s；變性95 ℃、5 s，退火，各引物對應時間30 s，延伸72 ℃、30 s（變性、退火和延伸35 個循環）；延伸72 ℃，10 min。

1.4 數據統計分析

應用SPSS 20.0軟件進行統計分析，檢驗實驗數據的正態分布性，差異性分析采用雙因素方差分析（Two way-ANOVA）進行LSD多重比較，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。相關性采用雙變量相關分析（Pearson），檢測相關水平為r＝0.05。

2 結果與分析

2.1 飼養方式對脂肪代謝基因表達量的影響

2.1.1 脂肪酸脫氫酶

由圖1可知，不同飼養方式對脂肪組織中脂肪酸脫氫酶基因（SCD、FADS1、FADS2和Elove5）表達量均有影響。在圈養條件下，SCD基因在脂肪組織中表達量顯著高于放牧條件（P＜0.05）。由于SCD基因主要促進油酸的合成[13]，在脂肪合成過程中，油酸更容易成為酰基輔酶A膽固醇酰基轉移酶和二脂酰甘油酰基轉移酶合成底物，從而生成膽固醇酯和甘油三酯，而這兩者是動物體內最主要的中性脂成分[14]，SCD基因在放牧組脂肪中的表達量顯著低于圈養組，因此推斷放牧條件不利于脂肪的合成。卜登攀等[15]證明在飼料中添加亞麻酸對SCD基因表達具有抑制作用，同時有研究證明牧草中含有較多的亞麻酸和亞油酸等多不飽和脂肪酸[16]，因此牧草中高含量的亞麻酸可能是抑制放牧組SCD基因表達的原因之一。

圖 1 飼養方式對不同脂肪組織中脂肪酸脫氫酶基因表達量的影響Fig. 1 Effects of two different feeding patterns on the expression of fatty acid desaturase gene in different adipose tissues

放牧條件下，脂肪組織中FADS1、FADS2和Elove5基因表達量高于圈養條件，特別在放牧組肌內脂肪中這3 種基因的表達量顯著高于圈養組（P＜0.05）。這與Urrutia等[17]對羔羊日糧中添加亞油酸的研究結果一致，在飼料中添加亞油酸對腎脂和尾脂中FADS1、FADS2和Elove5基因表達量未產生顯著影響，但可以促進肌內脂肪中FADS1和FADS2基因表達，從而可能使肌內脂肪中二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等多不飽和脂肪酸的沉積。

2.1.2 脂肪合成調節酶

圖 2 飼養方式對不同脂肪組織中脂肪合成分解酶基因表達量的影響Fig. 2 Effects of two different feeding patterns on the expression of fat decomposition and synthesis enzyme genes in different adipose tissues

如圖2所示，不同飼養方式對脂肪合成分解酶基因（ACC和LPL）表達量有顯著影響。在不同飼養方式下，脂肪組織中ACC基因的表達量均無顯著差異（P＞0.05）。ACC是脂肪酸合成的限速酶，參與催化脂肪酸合成的第一步反應[18]，楊若琳等[19]研究發現ACC活力大小與脂肪酸含量的高低有很大關系，說明ACC基因的高表達有利于脂肪酸的沉積，可推測出不同飼養方式對脂肪組織中脂肪酸沉積無影響。研究發現圈養對肌肉組織ACC基因表達量的影響為顯著高于放牧組[4]，與本實驗結果存在差異，可能由于不同品種間ACC基因的表達有差異。

LPL能夠將血液中乳糜微粒和極低密度脂蛋白所攜帶的甘油三酯分解成甘油和脂肪酸，向有關組織提供合成甘油三酯所需的原料，對脂肪沉積起著重要的調控作用[20]，其活力的高低是評價脂肪儲積能力的重要指標之一[21]，放牧條件下，脂肪組織中LPL的表達量高于圈養條件，在尾脂和腎脂中放牧組顯著高于圈養組（P＜0.05）；因此推測放牧條件有助于脂肪組織中脂肪的沉積，特別是對脂肪儲存影響較大。

2.1.3 脂肪酸轉移酶和調控因子

圖 3 飼養方式對不同脂肪組織中CPT1和FABP4基因表達量的影響Fig. 3 Effects of two different feeding patterns on the expression of CPT1 and FABP4 in different adipose tissues

由圖3可知，不同飼養方式對脂肪組織中脂肪酸轉移酶基因（FABP4和CPT1）表達量有影響。放牧條件下，肌內脂肪組織中CPT1基因的表達量高于圈養條件，但差異不顯著（P＞0.05），有研究表明日糧中亞油酸的含量與CPT1基因的表達量呈正相關[22]，可以推測牧草中亞油酸的含量是導致放牧組肌內脂肪組織中CPT1高表達的原因之一。放牧條件增加FABP4基因在脂肪組織中表達量，但差異不顯著（P＞0.05），這與Dervishi等[4]的研究結果一致。

圖 4 飼養方式對不同脂肪組織中PPARγ基因表達量的影響Fig. 4 Effects of two different feeding patterns on the expression of PPARγ in different adipose tissues

如圖4可知，放牧條件下可增加肌內脂肪和尾脂中PPARγ基因在脂肪組織中的表達量，但差異不顯著。PPARγ具有脂肪組織特異性，能被脂肪酸和外源性過氧化氫酶增殖劑激活，從而調控脂質代謝酶的表達[21]，它和SREBP1促進甘油三酯合成脂肪組織，是調控脂肪生成的關鍵酶之一[23]，也有研究證明PPARγ基因的表達與脂肪沉積率呈正相關[24]，由此得出，放牧組蘇尼特羊脂肪組織中脂肪沉積可能會高于圈養組，但對肌內脂肪的沉積沒有明顯影響。

2.2 不同脂肪組織中脂肪代謝基因表達量差異性分析

由表2可知，不同脂肪組織間脂肪代謝基因表達量存在顯著差異。在尾脂中SCD和ACC的表達量顯著高于肌內脂肪和腎脂（P＜0.05），SCD和ACC基因的高表達量有助于脂肪的沉積，因此導致兩種基因在尾脂中的表達量顯著高于其他兩種脂肪組織。在肌內脂肪中FADS1和FADS2基因表達量顯著高于尾脂和腎脂（P＜0.05），這2 種酶是生成長鏈不飽和脂肪酸的關鍵酶，因此可以證明在同一機體中肌肉是營養價值較高的部位。Elove5基因在背最長肌中的表達量顯著高于尾脂（P＜0.05）。在腎脂中LPL基因的表達量顯著高于肌內脂肪（P＜0.05），有研究發現LPL基因表達量在不同部位存在差異且在肌內脂肪中表達量低于其他脂肪組織[17,25]，LPL基因在腎脂中表達量最高，其次為尾脂中，在肌內脂肪中表達量最低，本實驗結果驗證了這一結論。

表 2 不同脂肪組織中脂肪代謝基因表達量差異性分析Table 2 Differential analysis of fat metabolism genes expression in different adipose tissues

不同脂肪組織中脂肪酸轉移酶和調控因子的基因表達存在顯著差異。肌內脂肪中FABP4基因表達量顯著低于其他兩個部位（P＜0.05）。FABP4基因作為脂質積累調控的下游關鍵基因，其高表達量有助于脂肪沉積[26]，推斷其在肌內脂肪中的表達量顯著降低，本實驗驗證了這一推斷。CPT1基因在肌內脂肪中表達量顯著高于尾脂和腎脂（P＜0.05），張艷芳[27]發現豬肉CPT1基因的高表達有利于肌內脂肪的沉積，本研究中放牧組蘇尼特羊肌內脂肪中的CPT1基因mRNA表達量較高，可以推斷放牧條件有利于蘇尼特羊肌肉中脂肪的沉積。PPARγ基因在尾脂和腎脂中的表達量顯著高于肌內脂肪（P＜0.05），大小為尾脂＞腎脂＞肌內脂肪。林婄婄等[28]研究發現PPARγ基因在淺層脂肪組織（尾脂、皮下脂肪）中的表達量低于深層脂肪組織，并推測因淺層脂肪組織儲存大量的脂肪從而使PPARγ基因在尾脂和皮下脂肪組織中表達量較高，本實驗驗證了這一結論。

2.3 脂肪酸代謝基因間mRNA水平相關性分析

由表3～5可知，脂肪組織中脂肪酸脫氫酶與脂肪合成分解酶基因的mRNA基因表達量相關性分析發現，ACC與SCD基因表達量呈負相關（P＞0.05）。說明了當ACC高表達時促進了SCD基因表達量的升高，使脂肪組織中單不飽和脂肪酸的含量增加。LPL是脂肪分解的關鍵酶，這些酶通過調控體內甘油三酯的水解，來降低體脂合成和沉積，并促進脂肪酸的氧化[29]。本實驗結果表明，當LPL基因表達量高時會抑制SCD基因表達，使機體中脂肪含量降低同時降低脂肪組織中單不飽和脂肪酸含量。

對脂肪酸脫氫酶與脂肪酸轉移酶和調控因子相關性分析中，脂肪組織中FADS1和FADS2與CPT1和FABP4基因表達量呈負相關，但相關性不顯著（P＞0.05），FABP4作為膜周邊蛋白，分子中心有高親和力的長鏈脂肪酸結合位點，能可逆地與長鏈脂肪酸以非共價結合，參與飽和及不飽和長鏈脂肪酸的代謝和轉運[30]，當FABP4基因的表達量高時會抑制FADS1和FADS2基因表達，不利于長鏈脂肪酸的沉積；因此通過調控FABP4基因的表達促進脂肪組織中長鏈脂肪酸的沉積還需進一步研究。在肌內脂肪中FADS1和FADS2與PPARγ基因表達存在顯著正相關（P＜0.05），PPARγ作為脂肪沉積的重要的調節因子，其高表達正向調控FADS1和FADS2基因的表達量，使羊肉中肌內脂肪中不飽和脂肪酸沉積，從而改善羊肉嫩度和營養價值；在尾脂和腎脂中FADS1和FADS2與PPARγ基因表達量負相關，但相關性不顯著（P＞0.05），與上述肌內脂肪相關性分析得到的結果相反，推測基因在不同部位中的表達可能存在差異。

表 3 肌內脂肪中脂質代謝基因mRNA表達量的相關性Table 3 Correlation of lipid metabolism genes in intramuscular adipose tissues

表 4 尾脂中脂質代謝基因mRNA表達量的相關性Table 4 Correlation of lipid metabolism genes in tail adipose tissues

表 5 腎脂中脂質代謝基因mRNA表達量的相關性Table 5 Correlation of lipid metabolism genes in perirenal adipose tissues

3 討 論

本實驗通過實時熒光定量PCR分析不同飼養方式下脂肪代謝相關基因表達量的差異，得到放牧組LPL基因在尾脂和腎脂中的表達量顯著高于圈養組（P＜0.05），因此放牧條件更有利于儲能脂肪的沉積。圈養組SCD基因表達量顯著高于放牧組（P＜0.05），表明圈養方式有利于促進油酸的合成，Nuernberg等[31]驗證了這一結果。對飼養方式影響脂肪組織中脂肪酸含量和種類的研究發現放牧方式有利于多不飽和脂肪酸的沉積[31-33]，本實驗得出放牧組中FADS1、FADS2和Elove5基因表達量顯著高于圈養組（P＜0.05），可以證明放牧方式有利于亞麻酸、DHA和EPA的沉積的原因之一是脂肪酸脫氫酶基因的高表達。

通過不同脂肪組織間脂肪代謝相關基因mRNA基因表達量差異性分析發現，肌內脂肪中FADS1和FADS2的基因表達量顯著高于其他兩組（P＜0.05），研究發現肌內脂肪有利于C18:2、C18:3、C20:5和C20:6的沉積[33]，實驗結果與上述結論一致。PPARγ基因在尾脂和腎脂中的表達量顯著高于肌內脂肪（P＜0.05），由高到低依次為尾脂＞腎脂＞肌內脂肪，說明蘇尼特羊尾脂的合成強度明顯高于其他兩個脂肪組織，這一結論完全符合肉羊中脂肪沉積規律，即皮下脂肪最先沉積，接著是尾部脂肪和內臟貯脂，最后沉積于肌肉內[34]。

脂肪代謝基因間相關性分析發現，在蘇尼特羊脂肪組織中，通過調控SCD基因的表達量可以調節脂肪的沉積。CPT1和FABP4基因的高表達量有利于脂肪組織中EPA和DHA的沉積。在尾脂和腎脂中PPARγ基因的高表達不利于C18:2和C18:3的沉積。以上研究都證明采用分子生物學的手段調控基因表達對脂肪和脂肪酸的沉積有顯著影響。由此可知，飼養方式會影響脂肪代謝相關基因的表達，進而調控脂肪沉積。目前為適應生態與畜牧業發展雙贏的目標，內蒙古、新疆和青海等地羊養殖方式由傳統放牧散養到集中圈養是大勢所趨，如何在圈養條件下控制羊的運動量、改變飼料營養水平，從而改善舍飼羊的肉用品質和營養品質是未來的研究核心和方向。