硫酸小檗堿對豬輪狀病毒感染的IPEC-J2中TGF-β1、EGFR、EGF、IGF1 mRNA表達的影響

徐環葉，李妹玲，陳立功,，王麗葉，孟利佳，崔 歡，張 誠，白 曉，王迎春，董世山,*

(1. 河北農業大學動物醫學院，保定 071001； 2.農業部動物疫病病原生物學華北科學觀測實驗站，保定 071001； 3.邯鄲市涉縣農牧局，邯鄲 056400)

仔豬腹瀉是各國養豬業發展中遇到的普遍難題，其中病毒性腹瀉在規模化豬場的發病率呈明顯上升趨勢[1]，豬輪狀病毒是引起仔豬腹瀉的病原之一，病毒主要侵害小腸，導致腸道黏膜損傷，使小腸吸收功能失調，從而引起腹瀉，臨床表現為嘔吐、水樣腹瀉等癥狀[2]。因此，如何采取有效措施保護和修復腸道損傷，防治仔豬的腹瀉，提高仔豬成活率，已成為養豬生產中亟待解決的問題。

小檗堿又名黃連素[3]，是從中藥黃連等植物中提取的異喹啉類生物堿，其硫酸鹽衍生物即硫酸小檗堿(berberine sulfate，BS)，在人醫和獸醫臨床都具有確切的抗腹瀉功效，能明顯延長小腸傳遞時間，對治療消化道黏膜損傷和潰瘍效果較佳。

近年來，許多文獻報道小檗堿具有抗病原體、抗毒素、調節機體免疫功能等藥理作用[4-6]，關于其對腸道修復因子基因表達的影響尚未見相關報道。腹瀉期間腸道黏膜損傷后，腸道修復受多種修復因子調節。其中促進仔豬腸道發育和修復的生長因子主要有轉化生長因子(TGF-β1)、表皮生長因子受體(EGFR)、表皮生長因子(EGF)、類胰島素生長因子(IGF1)。這些因子不僅能夠調控腸上皮細胞的增殖、轉化，刺激腸道發育，并且能修復受損的腸道黏膜，是腹瀉治療的關鍵[7-9]。前期研究已經利用MTT法篩選BS對體外培養的IPEC-J2最大安全濃度為20 μmol·L-1，本研究通過PoRV感染IPEC-J2建立試驗模型，攻毒前(預防組)和攻毒后(治療組)使用濃度為0、5、10 μmol·L-1的BS進行干預，同時設空白對照組，對黏膜修復因子基因表達情況進行分析，以揭示BS防治腹瀉的作用機制是否與調控腸道修復因子的表達有關，對豐富中獸醫理論和開發防治仔豬腹瀉的中藥制劑意義重大。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞

仔豬腸黏膜上皮細胞(IPEC-J2)，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；Marc145細胞，由本試驗室保存；豬輪狀病毒(CVCCAV55)，購自中國獸醫微生物菌種保藏管理中心。

1.2 主要試劑

硫酸小檗堿，購自上海源葉生物制品有限公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、熒光定量試劑盒，均購自寶生物工程(大連)有限公司；pEASY-T1Cloning Kit和Trans1-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell，購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 IPEC-J2細胞分組與處理

治療組：將細胞接種到6孔細胞培養板，各攻毒200 μL，37 ℃感作1 h，棄掉病毒液，加維持液正常培養24 h后，棄掉維持液，分別加濃度為0、5、10 μmol·L-1的硫酸小檗堿2 mL，給藥后，繼續培養，在6、12、24、36、48 h時，于顯微鏡下觀察細胞生長狀態，拍照保存后收集細胞，備用。

預防組：首先在各孔細胞中加濃度為0、5、10 μmol·L-1硫酸小檗堿2 mL，分別在6、12、24、36、48 h時將藥液吸出，各攻毒200 μL感作1 h，加維持液培養24 h，于顯微鏡下觀察細胞生長狀態，拍照保存后收集細胞，備用。

空白對照組：細胞接種到6孔細胞培養板，不進行攻毒和藥物處理，細胞維持液培養。每個樣品重復3次。

1.4 熒光定量PCR標準曲線的建立

1.4.1 細胞總RNA的提取 選擇上述培養的空白對照組IPEC-J2細胞，采用TaKaRa試劑盒進行操作，提取細胞總RNA，使用核酸蛋白測定儀測定總RNA的濃度和純度，并分裝出5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳。RNA產物-80 ℃保存，備用。

1.4.2 反轉錄 反轉錄合成cDNA參照相關試劑盒的操作(Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)，反應體系20 μL。如下：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL， gDNA Eraser 1.0 μL，Total RNA 1.0 μL，用RNase Free dH2O補足10.0 μL。室溫反應5 min。再添加PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL， RT Primer Mix 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer 2(for Real-Time) 4.0 μL，RNase Free dH2O 4.0 μL，混勻后37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。反轉錄產物-20 ℃保存，備用[10-11]。

1.4.3 引物設計 根據GenBank中已發布的豬TGF-β1(NM_214015.1)、EGFR(NM_214007.1)、EGF(NM_214020.1)、IGF1(NM_214256.1)、β-actin(XM_003124280.4)的基因序列為模板，采用Premier5.0軟件設計引物(表1)，由上海生物工程公司合成。

表1目的基因引物序列和擴增片段長度

Table1Primersequenceandlength

基因Genes引物序列(5'→3')Sequence of primer擴增長度/bpLengthTGF-β1-FGTGGAAAGCGGCAACCAA119TGF-β1-RGCCCGAGAGAGCAATACAGGEGFR-FATCTGTAACCCGCTGTGCTC147EGFR-RGGCATTCTCCACGAACTCTCEGF-FTGGCAGATGCTGGAATATCA120EGF-RTCTCTTGCCTTGTCCCATTCIGF1-FATCACATCCTCTTCGCATCTCTT145IGF1-RTGAAATAAAAGCCCCTGTCTCCβ-actin-FAGAGCAAGAGAGGCATCCTG111β-actin-RCACGCAGCTCGTTGTAGAAG

1.4.4 目的基因的克隆與標準品質粒的構建 參照TaKaRa EsTaqPCR試劑盒對TGF-β1、EGFR、EGF、IGF1和β-actin部分片段進行PCR擴增。反應總體積為50 μL， 2×EsTaqDNA Polymerase 25 μL，上下游引物各1 μL， cDNA 5 μL，滅菌蒸餾水18 μL。PCR產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用膠回收試劑盒回收目的基因后，產物與pEASY-T1Cloning Kit載體連接，轉化到Trans 1-T1感受態細胞，過夜培養，挑選陽性菌落，LB培養基(含氨芐抗性)振蕩培養12 h，提取重組質粒[12-13]。將所獲重組質粒進行PCR鑒定，挑取陽性克隆送上海生物工程技術服務有限公司進行測序鑒定。

1.4.5 標準曲線的建立 將測序結果為陽性的重組質粒DNA，使用核酸蛋白測定儀測定質粒濃度，并換算成標準品拷貝數，倍比稀釋成105、106、107、108、109copies·μL-1，以不同濃度的質粒為模板，進行熒光定量PCR反應，儀器收集熒光信號，以質粒拷貝數為橫坐標，Ct值為縱坐標，根據熒光值的變化規律，系統將自動生成標準曲線和熔解曲線。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s， 40個循環；循環完成后加一產物熔解曲線，用來分析熒光定量PCR反應的特異性，條件：95 ℃降至65 ℃，每5 s降溫0.5 ℃。每個樣品孔重復三次，同時每個基因設立3個無模板陰性對照。

1.5 不同組IPEC-J2中TGF-β1、EGFR、EGF、IGF1 mRNA表達的測定

1.5.1 樣本細胞IPEC-J2總RNA的提取與cDNA的合成 將上述培養的治療組和預防組IPEC-J2，按照寶生物工程(大連)有限公司試劑盒進行總RNA的提取與cDNA的合成。

1.5.2 實時熒光定量PCR檢測樣本 嚴格按照SYBR Premix ExTaqTMⅡ試劑盒說明書，將上述合成的標準樣品和待測樣品的cDNA進行實時熒光定量PCR擴增和檢測，測定TGF-β1、EGFR、EGF、IGF1基因mRNA表達水平。最后，對待測樣品進行定量分析。

1.6 統計分析

2 結 果

2.1 不同處理對IPEC-J2生長狀態的影響

顯微鏡下可見，空白組IPEC-J2單層貼壁生長，排列整齊，生長狀態良好，呈梭形、多角形或卵圓形(如圖1A)；PoRV作用24 h后，IPEC-J2出現聚集成團、變性、脫落壞死甚至崩解死亡的現象(如圖1B)；預防組(如圖1C)和治療組(如圖1D)在PoRV攻擊前后使用BS藥物干預，可見IPEC-J2雖然部分細胞出現成團現象，但仍處于單層生長和緊密排列狀態，細胞的生長狀態明顯好于攻毒不給藥組。

A.空白組IPEC-J2生長狀態(100×)；B. PoRV作用24 h后IPEC-J2生長狀態(100×)；C. 預防組IPEC-J2，其中用藥濃度為10 μmol·L-1，作用時間12 h (100×)；D. 治療組IPEC-J2，其中用藥濃度為10 μmol·L-1，作用時間12 h (100×)A.The growth state of IPEC-J2 in the blank group (100×); B. The growth state of IPEC-J2 treated by PoRV after 24 hours (100×); C. The growth state of IPEC-J2 in the prevention group, in which the concentration of the drug was 10 μmol·L-1 and the time was 12 h (100×); D. The growth state of IPEC-J2 in the treatment group, in which the concentration of the drug was 10 μmol·L-1 and the time was 12 h (100×)圖1 不同處理對IPEC-J2生長狀態的影響Fig.1 The effection of different treatments on growth state of IPEC-J2

2.2 熒光定量標準曲線的構建

2.2.1 總RNA提取情況 通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢測，提取的總RNA完整性良好。檢測樣品的OD260nm/OD280nm值在1.8～2.0之間，RNA純度較高，適合后續試驗。

2.2.2 重組質粒的鑒定 把提取的質粒DNA做為模板，采用PCR進行擴增，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質粒上的目的基因，結果為陽性，結果見圖2；將陽性菌液序列測定結果與GenBank中登錄的各目的基因序列進行比較，相似性均為100%，說明擴增片段為各目的基因的特異片段，可進行后續試驗。

2.2.3 基因擴增動力學曲線 構建各基因標準曲線，進行三次生物學重復，重復性較好。各基因的擴增效率均在95%～105%，線性回歸系數均大于0.99，表明在一定范圍內，起始模板與Ct值之間呈良好的線性關系，反映了目的產物的擴增效率較好。熔解曲線峰值單一，表明在擴增過程中，無引物二聚體和其他非特異性產物擴增，引物具有很好的特異性，說明結果準確可靠。

M. DL1000 DNA相對分子質量標準；1. IGF1基因PCR產物; 2. EGFR基因PCR產物; 3. EGF基因PCR產物; 4. TGF-β1 基因PCR產物; 5. β-actin基因PCR產物M. DL1000 DNA marker;1. PCR product of IGF1 gene; 2. PCR product of EGFR gene; 3. PCR product of EGF gene; 4. PCR product of TGF-β1 gene; 5. PCR product of β-actin gene圖2 目的基因的PCR擴增產物Fig.2 PCR product of target gene

2.3 不同處理組細胞基因的轉錄量

從表2可見，BS對TGF-β1mRNA表達具有促進作用，5 μmol·L-1的BS無論攻毒前后用藥，TGF-β1mRNA表達比對照組顯著升高(P<0.05)；10 μmol·L-1的BS能夠極顯著升高TGF-β1mRNA的表達(P<0.01)。

分組Groups濃度/(μmol·L-1)Concentration藥物作用時間/h Treatment time612243648攻毒前預防用藥組BS pre-treatment groups01.01±0.03 1.02±0.11 1.10±0.01 1.12±0.06 1.04±0.12 51.67±0.18*1.71±0.10*2.27±0.11*1.59±0.01*1.62±0.02*103.53±0.61**3.50±0.44**4.47±0.14**3.40±0.20**3.59±0.04**攻毒后治療用藥組BS post-treatment groups00.97±0.03 1.05±0.12 1.08±0.04 1.04±0.12 1.04±0.0251.46±0.14*1.56±0.19*2.38±0.07*1.48±0.06*1.60±0.03*103.19±0.17**3.21±0.06**3.16±0.14**2.99±0.07**3.08±0.14**

與對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下表同

Compared with control group，* means difference between the treatments (P<0.05)，** means significant difference between the treatments (P<0.01). The same as below

由表3可知，BS對EGFRmRNA表達具有促進作用，6和12 h時，預防用藥組和治療用藥組較各對照組EGFRmRNA的表達有不同程度的升高，差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。其中預防用藥時間12 h，濃度為5、10 μmol·L-1，以及治療用藥6 h，濃度為10 μmol·L-1時，EGFRmRNA的表達較各對照組極顯著升高(P<0.01)；用藥時間6 h，預防用藥濃度為10 μmol·L-1和治療用藥濃度為5 μmol·L-1，以及用藥時間12 h，治療用藥濃度為10 μmol·L-1時，EGFRmRNA的表達較各對照組顯著升高(P<0.05)。藥物處理24、36和48 h組，組間差異不顯著。

分組Groups濃度/(μmol·L-1)Concentration藥物作用時間/h Treatment time612243648攻毒前預防用藥組BS pre-treatment groups00.84±0.21 1.03±0.36 0.82±0.29 0.75±0.25 1.09±0.11 51.03±0.13 3.11±0.26**0.84±0.30 0.87±0.27 1.13±0.23 101.46±0.07* 4.21±0.19**1.20±0.29 0.68±0.19 1.03±0.16 攻毒后治療用藥組BS post-treatment groups00.93±0.28 0.96±0.09 0.75±0.27 1.28±0.34 0.72±0.26 51.57±0.21* 1.11±0.13 0.90±0.20 1.34±0.23 0.73±0.11 102.07±0.21**2.05±0.10* 0.70±0.30 1.24±0.10 0.66±0.22

由表4可知，BS對EGFmRNA表達具有抑制作用，6、12和24 h時，預防用藥組和治療用藥組較各對照組EGFmRNA的表達不同程度的降低，差異顯著(P<0.05)或差異極顯著(P<0.01)。其中預防用藥時間12 h，用藥濃度為5和10 μmol·L-1時，EGFmRNA的表達較對照組極顯著減少(P<0.01)；其中預防用藥時間6 h，用藥濃度為10 μmol·L-1，治療用藥時間12 h，用藥濃度為5和10 μmol·L-1，以及治療用藥時間24 h，用藥濃度為10 μmol·L-1時，EGFmRNA的表達較各對照組顯著(P<0.05) 減少。其他藥物處理組，組間差異不顯著。

分組Groups濃度/(μmol·L-1)Concentration藥物作用時間/h Treatment time612243648攻毒前預防用藥組BS pre-treatment groups攻毒后治療用藥組BS post-treatment groups00.82±0.200.68±0.280.99±0.290.66±0.270.12±0.1550.48±0.190.03±0.001**1.24±0.230.65±0.150.24±0.12100.26±0.04*0.02±0.003**1.03±0.180.83±0.170.31±0.1801.03±0.261.14±0.210.73±0.241.16±0.161.13±0.1650.87±0.180.72±0.11*0.85±0.131.01±0.281.03±0.17100.84±0.170.50±0.09*0.29±0.09*1.07±0.270.89±0.12

由表5可知，BS對IGF1mRNA表達具有抑制作用，預防用藥12 h，用藥濃度為5和10 μmol·L-1時，IGF1mRNA的表達較對照組極顯著降低(P<0.01)；預防用藥時間6 h和治療用藥時間24 h，用藥濃度為5和10 μmol·L-1，以及治療用藥時間36 h， 濃度為10 μmol·L-1，IGF1mRNA的表達較對照組顯著(P<0.05) 降低。其他藥物處理組，組間差異不顯著。

分組Groups濃度/(μmol·L-1)Concentration藥物作用時間/h Treatment time612243648攻毒前預防用藥組BS pre-treatment groups攻毒后治療用藥組BS post-treatment groups00.87±0.130.63±0.260.72±0.130.79±0.210.63±0.1450.47±0.16*0.02±0.003**1.24±0.250.75±0.090.55±0.02100.31±0.17*0.01±0.004**1.09±0.190.63±0.180.57±0.0500.30±0.101.07±0.140.59±0.090.62±0.130.73±0.2850.25±0.141.03±0.180.43±0.16*0.50±0.080.35±0.26100.32±0.211.09±0.120.10±0.03*0.16±0.06*0.45±0.11

3 討 論

腹瀉是困擾養豬業的主要疾病。豬輪狀病毒感染引起腹瀉是由于小腸黏膜的損傷，新生的上皮細胞功能低下，腸吸收不良，造成腸腔滲透壓升高，從而導致腹瀉[14-16]。腸道黏膜損傷后的黏膜修復對腹瀉仔豬的轉歸至關重要。本試驗選定與腸黏膜損傷后修復密切相關的細胞因子TGF-β1、EGFR、EGF和IGF1作為研究對象，以揭示硫酸小檗堿防治腹瀉的作用機制是否與調控腸道修復因子的表達有關，對仔豬腹瀉的病理生理機制研究及其防治意義重大。

TGF-β1是一類具有多種功能的生長因子，在細胞生長、分化、炎癥反應以及細胞凋亡等過程的調控中發揮極為重要的作用[17]。張志楊[18]發現潰瘍性結腸炎(UC)患者TGF-β1表達有顯著增強趨勢，且和UC患者嚴重程度相關。林源等[19]發現，胃潰瘍(肝郁脾虛證)患者經健胃愈瘍顆粒劑治療后，TGF-β1及其mRNA表達增強，說明健胃愈瘍顆粒劑能通過促進胃黏膜TGF-β1等促潰瘍愈合因子的表達來加速潰瘍的愈合。本試驗結果顯示硫酸小檗堿攻毒前或后給藥都能明顯改善IPEC-J2生長狀態，對IPEC-J2具有良好保護作用。同時BS劑量依賴性增強TGF-β1的表達，表明BS可能通過調節腸黏膜細胞TGF-β1mRNA的表達達到保護和促進黏膜修復，進而實現對腹瀉的防治作用。

EGFR屬于跨膜受體酪氨酸蛋白激酶家族，是TGF和EGF的通用受體[20]，EGFR在正常機體胃腸黏膜的上皮細胞分泌較少，損傷時可見EGFR分布區的表達明顯增加[21]。對胃黏膜的保護及其損傷的修復有重要作用[22]。本試驗結果顯示損傷的IPEC-J2經硫酸小檗堿處理后，EGFRmRNA表達顯著增強，同時配體TGF-β1表達顯著增強，共同促進IPEC-J2生長和黏膜修復。說明硫酸小檗堿可能通過調節腸道上皮細胞EGFR的表達進而促進損傷愈合。

EGF是一個很強的促細胞分裂因子，能增強胃黏膜細胞抵抗胃酸的侵蝕能力，在保護胃黏膜免受損傷因子破壞[23]，維持胃黏膜完整性方面起著非常重要的作用。顧玲[24]發現膽胃寧顆粒通過提高EGF的含量，促進上皮細胞增生，增強胃黏膜防御功能，從而促進胃潰瘍的愈合。本試驗發現損傷IPEC-J2經硫酸小檗堿處理后，EGFmRNA表達與對照組相比顯著降低，由于TGF與EGFR結合競爭力更強，TGF-β1顯著表達可能導致EGF表達抑制，也可能由于EGF與EGFR表達具有反向調控作用[25]。BS促進EGFR表達同時反向抑制了EGF的表達，實現EGFR與TGF-β1協同表達增強對腸黏膜上皮細胞保護和促進修復作用。

IGF1是含有70個氨基酸的堿性多肽，是一類廣譜性的促生長因子。研究表明IGF1與胚胎分化、個體發育密切相關，參與糖、脂肪和蛋白質代謝，可刺激細胞代謝，與其他生長因子協同，刺激腸道細胞的增殖[26-27]。一些研究表明，通過口服可以刺激新生動物胃腸道組織的生長和功能的成熟[28]。仔豬可通過添加外源生長因子加強腸道的生長和發育[29]。本試驗觀察到IPEC-J2損傷后利用BS治療過程中出現IGF1mRNA的表達顯著降低，說明硫酸小檗堿對IGF1表達具有抑制作用，具體機制還需要進一步研究。

本研究采用SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR的檢測方法，通過構建目的基因TGF-β1、EGFR、EGF、IGF1與內參基因β-actin的標準曲線對各基因擴增效率進行檢測[30]。結果表明：在不同的稀釋條件下，各目的基因稀釋倍數的對數值與其Ct值之間呈線性關系，經過PCR反應體系的優化[31]，本試驗各基因對應的標準曲線斜率均在-3.6～-3.0，此時得到的標準曲線可靠性較高；各基因的擴增效率均在95%～105%，說明引物設計合理，線性關系好，標準品梯度稀釋恰當；當樣本稀釋到105時，仍能夠檢測到擴增產物，提示該方法有良好的靈敏度。各目的基因和內參基因相關系數R2均大于0.99，表明在一定范圍內，起始模板與Ct值之間呈良好的線性關系，反映目的產物的擴增效率較好。熔解曲線峰值單一，表明在擴增過程中，無引物二聚體和其他非特異性產物擴增，引物具有很好的特異性，說明結果準確可靠[32]，為后續試驗奠定良好基礎。

4 結 論

本研究通過PoRV感染IPEC-J2建立試驗模型，分攻毒前后使用BS進行干預，對黏膜修復因子基因表達情況進行分析。PoRV能夠顯著引起IPEC-J2變性和壞死脫落，用BS藥物組的IPEC-J2則生長基本良好。BS有促進病毒損傷IPEC-J2中TGF-β1和EGFRmRNA表達，抑制EGF和IGF1mRNA表達的作用。預防組和治療組比較，預防組在時間上表現更提前。在腸黏膜細胞損傷修復過程中，各細胞因子發揮的作用以及作用時間存在差異。提示，中藥提取物BS可能通過調節損傷的腸黏膜上皮細胞修復因子的基因表達，進而調控腸道上皮細胞的轉化和發育，對損傷的腸道黏膜起到保護和修復功能。