炎性因子對星形膠質細胞的活化及sPLA2-ⅡA表達的機制及影響

李雪粉，陳文武，李青，郭安臣，王擁軍，王群

隨著人們對神經系統疾病研究的深入發現，在神經系統疾?。ㄈ缒X梗死、腦出血等）的病理過程中，神經炎癥的級聯反應是很重要的環節[1]。在神經炎癥級聯反應中，星形膠質細胞（astrocyte，AST）活化并發揮重要作用[2-3]。眾所周知，適當的炎癥有神經保護作用，但炎癥級聯過度反而會加重腦組織的損傷。本實驗通過在體外培養大鼠AST，在培養基中加入炎性因子白介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α），構建AST的炎癥模型，并進一步探究其內在的炎癥通路，為神經系統疾病的炎癥發病機制提供實驗依據。

1 研究對象與方法

1.1 材料 新生Sprague-Dawley（SD）大鼠（出生24 h內，雌雄不分，北京維通利華），細胞黏附劑C1010（北京普利萊），DMEM/F12培養基（美國Gibco），胎牛血清（美國Gibco），雙抗（青霉素、鏈霉素）（美國Gibco），L-谷氨酰胺（美國Sigma），0.25%胰酶（美國Gibco），4%多聚甲醛（北京索萊寶），聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）（美國Sigma），山羊血清（北京中杉金橋），鼠多克隆抗膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）（北京冠星宇），Alexa-Fluor 488標記的羊抗鼠熒光二抗（美國Gibco），4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液（美國Sigma），大鼠IL-1β（美國P E P R O T E C H），大鼠T N F-α（美國PEPROTECH），Trizol試劑（美國Ambion），異丙醇（上海國藥化學），三氯甲烷（北京化工廠），核-漿蛋白分離試劑盒（北京普利萊），蛋白酶抑制劑（北京普利萊），蛋白磷酸酶抑制劑（北京普利萊），BCA蛋白定量試劑盒（北京普利萊），細胞增殖-毒性檢測試劑盒（CCK-8）（日本同仁化學研究所），反轉錄試劑盒（日本Takara），聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（日本Takara），PCR引物（上海英濰捷基），分泌型磷脂酶A2-ⅡA（secretory phospholipase A2 of groupⅡA，sPLA2-ⅡA）酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海紀寧）。

1.2 方法

1.2.1 AST的原代培養 將培養瓶用細胞黏附劑C1010包被后放在37 ℃ 5%二氧化碳培養箱中過夜。將SD大鼠消毒后去除顱骨、腦干及小腦，夾出兩側大腦半球至培養皿中。去除腦膜、血管，剝離出大腦皮質組織，將組織移入另一含培養基的培養皿中，將組織剪碎后移入離心管，加2倍體積的0.25%胰酶，消化37 ℃15 min后加培養基終止消化。過濾并吸取濾過的液體放入新的離心管中，1000 rpm 5 min后留沉淀，加完全培養基混勻，以細胞密度3×105/ml接種放在二氧化碳培養箱中進行培養，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態，9～12 d后進行細胞傳代培養。

傳代培養：將培養瓶用細胞黏附劑C1010包被后放在37 ℃ 5%二氧化碳培養箱中過夜。0.25%胰酶消化2 min后加培養基終止消化。將細胞移入離心管中，1000 rpm 5 min。留沉淀以細胞密度3×105/ml進行接種。將培養瓶放在二氧化碳培養箱中進行培養，每天觀察細胞的形態以及生長情況等，4～5 d進行傳代，傳至第3代時進行AST的純度鑒定。

1.2.2 細胞純度的鑒定 預先用細胞黏附劑C1010包被4孔板，按照上述細胞傳代培養的方法，將第3代AST用0.25%胰酶消化后接種入4孔板，每孔細胞密度3×104/0.5 ml，即為第4代細胞。通過免疫熒光的方法對AST的純度進行鑒定。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3次，4%多聚甲醛固定30 min。0.2%TritonX-100靜置30 min。10%山羊血清封閉1 h后加一抗（一抗為鼠多克隆抗GFAP）室溫過夜。二抗（Alexa-Fluor 488標記的羊抗鼠熒光二抗），室溫避光放置1 h。DAPI復染5 min后，換為PBS。封片后在熒光顯微鏡下隨機取視野觀察，并采集圖片。

1.2.3 實驗分組

1.2.3.1 不同濃度炎性因子的干預 將第4代A S T接種入24孔板，每孔細胞密度3×104/0.5 ml。隨機分為對照組和實驗組，實驗組分別為：10 ng/ml IL-1β組，100 ng/ml IL-1β組，10 ng/ml TNF-α組，100 ng/ml TNF-α組，10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α組，100 ng/ml IL-1β+100 ng/ml TNF-α組。換為去血清培養基，1 h后對照組不做處理，實驗組處理如下：10 ng/ml IL-1β組每孔加1 μg/ml IL-1β 5 μl，100 ng/ml IL-1β組每孔加10 μg/ml IL-1β 5 μl，10 ng/ml TNF-α組每孔加1 μg/ml TNF-α 5 μl，100 ng/ml TNF-α組每孔加10 μg/ml TNF-α 5 μl，10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α組每孔分別加1 μg/ml IL-1β 5 μl和1 μg/ml TNF-α 5 μl，100 ng/ml IL-1β+100 ng/ml TNF-α組每孔分別加10 μg/ml IL-1β 5 μl和10 μg/ml TNF-α 5 μl。培養20～24 h期間進行細胞活力檢測。

1.2.3.2 選取10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α組繼續干預 將AST接種入6孔板，每孔細胞密度1×106/2 ml，隨機分為對照組和實驗組。換為去血清培養基，1 h后對照組不做處理，實驗組每孔分別加1 μg/ml IL-1β 20 μl和1 μg/ml TNF-α 20 μl。24 h后收集兩組培養液及細胞，進行各項指標的測定。

1.2.4 CCK-8檢測細胞活性，篩選有效炎性因子的濃度 按照1.2.3.1在24孔板中將細胞分為七組，其中20 h時每孔分別加CCK-8溶液50 μl。24 h時每孔分別抽取300 μl培養基至96孔板中。在酶標儀450 nm處檢測各孔的吸光度（optical density，OD）值。

1.2.5 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）

1.2.5.1 總RNA的提取 按照1.2.3.2培養細胞，24 h后PBS洗滌2次，加Trizol試劑，移入EP管室溫5 min。向EP管中加200 μl氯仿，冰上放置5 min。12000 rpm 4 ℃離心15 min，分相為3層。吸取上層至新的EP管中，加等體積的異丙醇，放在-20 ℃冰箱30 min冷卻。12000 rpm 4 ℃離心10 min，去上清，可見EP管附著白色沉淀，即為RNA。向EP管中加700 μl含焦碳酸二乙酯的75%酒精，輕輕彈起白色沉淀。7000 rpm 4 ℃離心10 min。倒掉75%酒精，向EP管中加20 μl無RNA酶的水（RNase-free water），渦旋溶解沉淀，混勻后即可進行RNA濃度檢測。

1.2.5.2 反轉錄反應 首先去除基因組的DNA ，采用10 μl的反應體系：5×gDNA Eraser Buffer 2 μl；gDNA Eraser 1 μl；Total RNA 1 μg；添加RNase-free water至10 μl。反應條件：42 ℃ 5 min，4 ℃放置。

反轉錄反應采用20 μ l的反應體系：含去除基因組的DNA中的反應液10 μl，5×PrimeScript Buffer 4 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μl，RT Primer Mix 1 μl，RNase-free water 4 μl。反應條件：37 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s，4 ℃放置。

1.2.5.3 實時熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR） 20 μl的PCR反應體系為：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 μl；Forward Primer 0.8 μl；Reverse Primer 0.8 μl；cDNA 2 μl；RNase-free water 6.4 μl。擴增反應時間為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。溶解反應時間為：95 ℃ 15 s，60 ℃退火30 s，95 ℃延伸15 s。2-△△Ct方法計算目的基因表達量（表1）。

1.2.6 sPLA2-ⅡA酶聯免疫分析 按照1.2.3.2培養細胞，24 h收集上清液進行實驗。標準孔分別加不同濃度的標準品50 μl。先向待測孔加入10 μl的待測品，再向待測品孔加入40 μl的待測品稀釋液（空白孔不加）。用封板膜將微孔完全封閉后在37 ℃恒溫箱內放置30 min。揭掉封板膜，每孔加100 μl的酶標試劑（空白孔不加），溫育30 min。揭開封板膜，倒掉液體，向各孔加滿洗滌液，1 min后棄洗滌液，拍干。重復洗滌5次。向各孔中加50 μl的顯色劑A，再向各孔中加50 μl的顯色劑B，37 ℃恒溫箱內避光放置15 min。向各孔中加50 μl的終止液。15 min內在酶標儀的450 nm處測定各孔的OD值（用空白孔調零）。

1.3 統計學處理 實驗均重復3次。采用SPSS 17.0進行統計分析，數據以（）表示，兩組比較采用兩組獨立樣本的t檢驗，兩組以上比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AST的純度 通過AST特異性的標志物GFAP染色進行鑒定。經免疫熒光染色后隨機選取的視野內，細胞核經DAPI染色后均為藍色（43個），AST中的GFAP染色后為綠色（43個）。由此，培養的細胞中AST比例達95%以上（圖1）。

2.2 不同濃度炎性因子對AST活性的影響 10 ng/ml IL-1β組、100 ng/ml IL-1β組、10 ng/ml TNF-α組、100 ng/ml TNF-α組、10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α組、100 ng/ml IL-1β+100 ng/ml TNF-α組對AST作用24 h后OD值分別為（2.35±0.03）、（2.38±0.05）、（2.35±0.06）、（2.44±0.02）、（2.84±0.16）、（2.70±0.06），均高于對照組（2.31±0.03），但其中只有100 ng/ml IL-1β組、100 ng/ml TNF-α組、10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α組和100 ng/ml IL-1β+100 ng/ml TNF-α組與對照組比較，差異有統計學意義（t=0.07、0.12、0.53、0.39，P＜0.05）。說明炎性因子可以使AST活性增加，尤其是IL-1β與TNF-α合用時效果更加顯著。

表1 聚合酶鏈式反應引物

圖1 原代培養傳至第4代的星形膠質細胞免疫熒光染色

2.3 炎性因子對AST內sPLA2-ⅡA表達的影響 選用10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α組進行實驗，設定對照組sPLA2-ⅡA的mRNA相對表達量為1，10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α組sPLA2-ⅡA的mRNA相對表達量為（7.34±2.41）。因此，當10 ng/ml IL-1β和10 ng/ml TNF-α聯合應用時，AST內sPLA2-ⅡA mRNA表達量顯著升高（t=9.615，P＜0.05）。

對照組和10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α組細胞培養24 h后，細胞內sPLA2-ⅡA蛋白分泌到上清液中，利用酶聯免疫法檢測上清液中sPLA2-ⅡA蛋白的分泌量。對照組上清液sPLA2-ⅡA蛋白表達量為（6.30±0.10）ng/ml，10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α組為（8.02±0.23）ng/ml。因此，聯合應用10 ng/ml IL-1β和10 ng/ml TNF-α能使AST內sPLA2-ⅡA的蛋白表達量顯著升高（t=11.635，P＜0.05）。

2.4 炎性因子對AST內NF-κB、IKKα、IKKβ mRNA表達的影響 選取10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α組進行實驗，設定對照組AST內NF-κB、IKKα、IKKβ的mRNA相對表達量為1，10 ng/ml IL-1β+10 ng/ml TNF-α組的NF-κB、IKKα、IKKβ mRNA相對表達量分別為（1.46±0.20）、（2.35±0.49）、（1.83±0.22）。因此，聯合應用10 ng/ml IL-1β和10 ng/ml TNF-α能使AST內NF-κB、IKKα、IKKβ mRNA表達量均顯著升高（t=4.015、4.719、6.509，P＜0.05）。

3 討論

炎性因子本質上是可溶性的多肽分子，它們和炎癥反應有著緊密的關系。其中，促炎因子主要有IL-6、IL-1β、TNF-α等，抗炎因子主要有IL-4、IL-10、IL-13等[4]。TNF-α是在炎癥反應中最早表達的炎性因子，由AST產生，能夠促進、誘導多種炎癥介質的產生[5]。在炎癥反應中IL-6和IL-1β的增加將會加重炎癥細胞的聚集，影響神經功能的恢復。IL-10具有抑制炎癥的作用，它能夠抑制炎性因子的合成，抑制炎癥細胞的遷移等[6-7]。本實驗首先在AST的培養基中分別加不同濃度組合的炎性因子，24 h后利用CCK-8檢測AST的活性變化。CCK-8結果表明，上述組合均能活化AST，其中10 ng/ml IL-1β和10 ng/ml TNF-α聯用效果最顯著，說明炎性因子能夠引起AST的活化。

將10 ng/ml IL-1β與10 ng/ml TNF-α同時加至培養基中24 h，通過qRT-PCR和ELISA檢測IKKα、IKKβ、NF-κB、p65和sPLA2-ⅡA的表達量變化，結果發現sPLA2-ⅡA、IKKα、IKKβ、NF-κB、p65的表達量均升高，說明促炎因子能夠促進炎癥的發生。

有研究表明，NF-κB信號通路參與了一系列的基因轉錄[8-10]。與實驗結果一致，本實驗中通過qRT-PCR和ELISA檢測到當有炎性因子存在時，AST活化同時NF-κB表達增多，其上游的IKKα、IKKβ表達量亦增多。因此，NF-κB是能夠啟動多種炎癥介質基因表達的關鍵轉錄因子[11]。另外，有研究表明在IKKβ敲除的小鼠中，NF-κB表達量顯著降低[12]。說明IKKβ在IKK復合物中可能起主要作用。

sPLA2-ⅡA分布廣泛，哺乳動物細胞、蜂毒和蛇毒中均存在。在sPLA2的亞型中，受人們關注的是sPLA2-ⅡA和它的抑制劑[13-16]。sPLA2-ⅡA和sPLA2-ⅤA均在腦組織中表達[17-18]，sPLA2-ⅡA研究較sPLA2-ⅤA多，是因為其參與了炎癥反應[19-20]。sPLA2-ⅡA能夠介導固有免疫和獲得免疫，并在很多炎癥性疾病中表達量增多[16，21]。sPLA2-ⅡA表達增多在大鼠缺血性卒中已得到驗證[22]。另外，體外實驗還表明sPLA2-ⅡA在神經元活動中起重要作用[23-25]。在本實驗中，通過qRT-PCR和ELISA的方法得出結果，炎性因子刺激后sPLA2-ⅡA表達量增多，說明炎性因子作用于AST后，AST活化，進而引起sPLA2-ⅡA表達量增多，水解膜磷脂的Sn-2位酯?；?，產生溶血卵磷脂和游離脂肪酸。溶血卵磷脂和游離脂肪酸不能及時代謝，發生聚集并形成類花生酸，進一步產生炎癥介質，從而導致炎癥級聯反應的發生。NF-κB的表達量增高的同時sPLA2-ⅡA表達量增高，說明炎性因子介導的AST sPLA2-ⅡA產生很有可能是通過IKKα/IKKβ-NF-κB-sPLA2-ⅡA通路進行的。當然，這需要更多的研究來證明確切的機制。

本次研究僅僅初步討論了在炎性因子作用下，AST的活性變化以及sPLA2-ⅡA表達量變化和其可能存在的內在機制，為神經系統疾病發生發展過程中的炎癥反應提供了一些實驗依據，更多的機制探討有待更深一步的研究。