沉默hnRNP A2/B1抑制人宮頸癌Hela細胞中cyclin D1/E表達的研究*

廖銘心，劉 瑤，蔡 僮，方 文

(貴州醫科大學醫學檢驗學院臨床生化教研室，貴陽 550004)

宮頸癌是目前威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一，尤其對于發展中國家來說其發病率更是居高不下[1]。據中國癌癥中心發布的數據顯示我國宮頸癌的發病率和病死率分別為10.4/105和2.59/105[2]。在尋求改善傳統治療方案的同時探索在基因水平上新的腫瘤抑制方法受到人們越來越多的關注。核內不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1,hnRNP A2/B1) 是hnRNPs家族中的一員，與mRNA的剪接、轉運及調控細胞生長和多種腫瘤的發生(如胃癌、非小細胞肺癌、膠質母細胞瘤等)有著密切的聯系[3-6]。本課題組前期用洛鉑作用于宮頸癌細胞后也發現hnRNP A2/B1表達下調并有細胞周期阻滯和抑制增殖的現象[7]。而細胞周期蛋白(cyclin)D1與cyclin E聯合可促進細胞通過G1期的限制點，cyclin D1、cyclin E在調控細胞周期進程中起到重要作用[8]，同時JOHN等[9]和BUTT等[10]總結發現cyclin D1和cyclin E 在多種腫瘤中表達都上調進而影響腫瘤的發展。本課題組前期已通過慢病毒介導沉默宮頸癌Hela細胞中的hnRNP A2/B1基因表達[11-12]，本研究擬進一步探討hnRNP A2/B1對細胞cyclin D1/E表達水平的影響并通過裸鼠移植瘤模型觀察沉默hnRNP A2/B1基因后對腫瘤生長情況的影響，闡明hnRNP A2/B1對宮頸癌發展的重要作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及主要試劑 4～6周BALB/c雌性裸鼠共18只，購自貴州醫科大學實驗動物中心。四甲基偶氮唑藍(MTT)相關試劑RIPA裂解液、BCA試劑盒購自碧云天生物技術公司；SYBR Green PCR Master Mix購自美國Biosystems公司；Trizol、逆轉錄試劑盒購自天根生物科技有限公司；兔抗hnRNP A2/B1抗體購自美國Invitrogen公司，兔抗cyclin D1和兔抗cyclin E抗體購自英國Abcam公司，兔抗β-actin、抗增殖細胞核抗原(PCNA)及免抗Ki-67抗體購自博奧森生物公司，辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的山羊抗兔二抗購自北京中山金橋生物技術有限公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；RPMI-1640培養液購自美國Hyclone公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒購自萬類生物公司；超敏ECL化學發光試劑盒和聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司；其余試劑均為國產分析純。

1.1.2主要儀器 Allegra高速臺式低溫離心機購自美國Beckman公司；Bio-rad680全波長酶標儀、Western blot垂直電泳槽購自美國Bio-rad公司；細胞培養箱購自日本三洋電機有限公司；Nikon-TE2000-U倒置相差顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2方 法

1.2.1慢病毒轉染沉默hnRNP A2/B1 慢病毒介導shRNA轉染沉默宮頸癌Hela細胞株步驟詳見參考文獻[11-12]。

1.2.2細胞培養 人宮頸癌Hela細胞株購自中國科學院細胞庫。將未沉默細胞株和沉默后的細胞株共分3組：正常Hela細胞組、陰性沉默對照組 (Hela-NC 組)、陽性沉默實驗組 (Hela-shRNA組)。各組細胞分別用含有10%的胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素和1% L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養液在37 ℃含5% CO2的細胞培養箱中培養，每2～3天換1次培養液。

1.2.3real-time PCR驗證沉默效率 取上述3組處于對數生長期的細胞，用Trizol試劑盒提取總RNA并測定濃度，根據反轉錄試劑盒步驟將RNA反轉錄成cDNA，每個樣品cDNA模板設立3個平行管。采用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行qRT-PCR反應擴增目的片段。PCR引物如下：β-actin正向引物：5′-GTC TCC TCT GAC TTC AAC AGC G-3′，反向引物：5′-ACC ACC CTG TTG CTG TAG CCA A -3′； hnRNP A2/B1正向引物：5′-GAT GGC AGA GAA CGG TGT GAA G-3′， 反向引物：5′-AGG CAT AGG TAT TGG CAA CTG C-3′。PCR的反應條件為：95 ℃，10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40次循環。根據PCR的擴增曲線和溶解曲線分析產物的特異性，以β-actin為內參，最終結果以2-△△Ct統計各組基因表達水平。

1.2.4Western blot 于冰上用含有1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液裂解各組細胞及移植瘤組織并在4 ℃離心機上以12 000 r/min離心20 min后收集上清蛋白液于-80 ℃保存備用。BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白并用濕轉法將蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液孵育2 h。然后4 ℃過夜孵育兔抗β-actin (1∶6 000)、兔抗cyclin D1 (1∶500)、兔抗cyclin E(1∶500)、兔抗hnRNPA2/B1(1∶500)一抗，之后用TBST洗3次，每次10 min，將PVDF膜在山羊抗兔二抗(1∶90 000)中室溫孵育1 h。ECL發光液顯影并曝光。用Image J軟件分析各組的灰度值。

1.2.5MTT檢測細胞增殖 用0.25% 的胰蛋白酶將Hela組、Hela-NC組及Hela-shRNA組的細胞消化下來并稀釋至5×104/mL，以每孔200 μL加入96孔板中并在37 ℃、5% CO2培養箱中分別培養12、24、48 h。然后每孔加入含10 μL MTT后繼續培養4 h，之后去除上清液并每孔加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)于酶標儀上充分震蕩10 min后在490 nm處檢測吸光度(A)值。

1.2.6構建裸鼠移植瘤模型 于貴州醫科大學實驗動物中心購入18只4周齡的雌性BALB/c裸鼠并用清潔級飼料飼養于無特定病原體(SPF)級動物房中。實驗對應細胞分3組，每組6只裸鼠。每只裸鼠于右背靠頸部皮下接種200 μL懸浮細胞液 (2×106/mL細胞懸浮于200 μL PBS中)。之后每3天用游標卡尺測量腫瘤體積大小并根據文獻中發表的公式計算體積[13]。腫瘤生長30 d后用10%水合氯醛麻醉并斷頸處死裸鼠收集腫瘤組織。

1.2.7免疫組織化學 移植瘤組織取出后用4%的中性甲醛固定24 h，之后脫水、石蠟包埋并制成4 μm厚的切片粘貼于載玻片上。之后二甲苯化蠟，梯度乙醇脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液高壓修復抗原3 min。0.3% H2O2阻斷非特異性抗原30 min，PBST洗3次后用10%的血清封閉液封閉20 min。4 ℃過夜孵育兔抗PCNA (1∶100)和兔抗Ki-67(1∶100)一抗，并以PBS代替一抗處理切片作為陰性對照。一抗孵育完畢并復溫40 min后在37 ℃水浴箱中孵育二抗20 min，之后DAB顯色，蘇木素復染并逆行脫水后用中性樹脂封片。棕色區域視為陽性區域，Image-Pro Plus6.0軟件分析各組組織中棕色區域的IOD值。

1.2.8蘇木素-伊紅(HE)染色 前期組織處理與免疫組織化學步驟類似。4 μm厚的切片經脫蠟和再水合后用蘇木素處理5 min，1%鹽酸乙醇分化1 s，伊紅染液處理3 min，逆行脫水后用中性樹脂封片。

2 結 果

2.1各組宮頸癌Hela細胞中hnRNP A2/B1基因表達情況比較 由慢病毒介導shRNA沉默hnRNP A2/B1基因的Hela-shRNA組與Hela組和Hela-NC組比較，hnRNA A2/B1表達降低(P<0.05)。qRT-PCR結果顯示Hela-shRNA組中的hnRNP A2/B1抑制效率達到(74.79±3.38)%，Western blot結果顯示Hela-shRNA組中hnRNP A2/B1蛋白的表達量相較于其他兩組明顯降低(P<0.05)，見圖1。

A：hnRNP A2/B1 mRNA；B：hnRNP A2/B1蛋白；a：P<0.05，與Hela組及Hela-NC組比較

圖1慢病毒介導shRNA沉默hnRNP A2/B1基因

2.2沉默hnRNP A2/B1對宮頸癌Hela細胞增殖的影響 對Hela組、Hela-NC組及Hela-shRNA組分別檢測各自在12、24、48 h時間點的增殖情況。Hela-shRNA組在48 h時間點的增殖情況較Hela組及Hela-NC組明顯降低 (P<0.05)，見圖2。

a：P<0.05，與Hela組及Hela-NC組比較

圖2沉默hnRNP A2/B1后各組的增殖水平比較

2.3沉默hnRNP A2/B1后對體外細胞cyclin D1及cyclinE表達的影響 Western blot結果顯示Hela-shRNA組的cyclin D1及cyclin E蛋白水平相較于Hela組及Hela-NC組明顯降低(P<0.05)，Hela組與Hela-NC組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

2.4沉默hnRNP A2/B1后對宮頸癌Hela細胞移植瘤的影響 對于接種Hela、Hela-NC及Hela-shRNA的3組裸鼠，在實驗期間各組行為都未見異常表現，飲食正常，各組存活率為100%。Hela-shRNA組的腫瘤生長相較于另外兩組明顯受到抑制，腫瘤體積明顯減小 (P<0.05)，見圖4。免疫組織化學結果顯示Hela-shRNA組中的增殖相關抗原PCNA及Ki-67表達較其余兩組均明顯降低(P<0.05)，見圖5、6，HE染色見各組切片中腫瘤細胞的病理形態呈現出細胞核深染，大小不一，核質比例失調，部分細胞形態不規則的現象，但各組之間的形態并無明顯差異，見圖6。另外移植瘤組織中的Western blot結果同樣顯示Hela-shRNA組的cyclin D1及cyclin E較其他兩組明顯降低(P<0.05)，見圖7。

A：Western blot;B:定量分析圖；a：P<0.05，與Hela組及Hela-NC組比較

圖3體外細胞中各組cyclin D1及cyclin E蛋白表達變化

a：P<0.05，與Hela組及Hela-NC組比較

圖4裸鼠移植瘤的生長情況

a：P<0.05，與Hela組及Hela-NC組比較

圖5免疫組織化學定量分析

圖6免疫組織化學及HE染色(×400)

A:Western blot;B:定量分析圖；a：P<0.05，與Hela組和Hela-NC組比較

圖7移植瘤組織中cyclin D1及cyclin E蛋白表達變化

3 討 論

由于宮頸癌在女性腫瘤的高發病率及惡性程度，目前許多學者都致力于尋找與宮頸癌相關的癌基因。據文獻報道，目前宮頸癌的發生發展與諸多基因都有關聯，而hnRNP A2/B1基因與宮頸癌的聯系鮮有報道，因此本研究希望在前期研究的基礎上進一步探索hnRNP A2/B1對調控宮頸癌細胞中周期相關蛋白的表達及其對細胞增殖和腫瘤生長的影響。

hnRNP A2/B1是一組由hnRNP A2和hnRNP B1蛋白質以適當比例結合涉及細胞轉錄和蛋白質翻譯的mRNA結合蛋白[3-4]。hnRNP A2/B1不受調控地在腫瘤組織中的高表達是促進腫瘤形成的原因之一[6]，甚至有研究報道將hnRNP A2/B1定義為一種原癌基因，尤其是在非小細胞肺癌中，hnRNP A2/B1已作為其腫瘤生物標記物及判斷預后的指標[14]。LI等[15]研究發現hnRNP A2/B1及其他部分hnRNPs家族的基因參與介導人乳頭瘤病毒16型(HPV-16)感染宮頸上皮的過程，同時也發現hnRNP A2/B1在宮頸癌中也是呈高表達狀態。本研究結果顯示沉默宮頸癌細胞中hnRNP A2/B1后其增殖及腫瘤生長等方面明顯受到抑制，這也印證了部分學者的結論，說明hnRNP A2/B1確實參與了宮頸癌的發生發展過程。

從體內及體外實驗結果均顯示cyclin D1及cyclin E在hnRNP A2/B1基因沉默后均表達下調，而這兩種蛋白對于調控細胞周期進程至關重要[8]，這說明hnRNP A2/B1有可能通過cyclin D1及cyclin E來調控宮頸癌中的細胞周期變化。趙向寨等[16]發現通過沉默hnRNPs家族中的 hnRNP H基因能夠下調子宮內膜癌Ishikawa細胞中的cyclin D1、CDK4的表達。而據CHOI等[17]報道，hnRNP A2/B1在維持人胚胎干細胞的自我更新及多功能性上具有重要意義，并通過沉默hnRNP A2/B1后也發現胚胎干細胞中的cyclin D1及cyclin E及cyclin B1表達下調，細胞周期阻滯于G1期。同時也有報道稱在肺腺癌中檢測到hnRNP B1升高而cyclin D1減少，協同二者的結果對肺腺癌及不典型增生的診斷具有重要意義[18]。而上述結論與本研究結論相一致，由此可以推斷cyclin D1及cyclin E在hnRNP A2/B1調控宮頸癌細胞周期進程中十分重要。細胞核增殖相關抗原Ki-67及PCNA均為存在于細胞增殖期的蛋白質,是增殖細胞標記物之一，常被用于許多腫瘤與非腫瘤組織通過免疫組織化學分析病理特性的標記物[19]，對于這兩種蛋白質的檢測有助于了解腫瘤細胞的增殖活性。本研究免疫組織化學結果顯示沉默hnRNP A2/B1后PCNA和Ki-67的表達均顯著減低，同時結合體外MTT細胞增殖實驗，說明hnRNP A2/B1能夠調控宮頸癌細胞的增殖活性。

綜上所述，本次通過沉默hnRNP A2/B1基因后對宮頸癌細胞體外及體內實驗的研究。結果顯示，hnRNP A2/B1在宮頸癌細胞中可能參與調控細胞增殖，并通過cyclin D1及cyclin E調控細胞周期進程，同時促進宮頸癌的生長。所以hnRNP A2/B1可能是治療宮頸癌的一個基因靶點，這將為未來對治療宮頸癌進一步研究提供一個實驗依據。