MK-2206與順鉑協同抑制人三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞增殖的研究*

楊 凡，劉鈺妮，王世恩，湯桂成，夏 燕，曹春雨2，▲

(1.三峽大學第二人民醫院腫瘤放化療科， 湖北宜昌 443000；2.湖北民族學院附屬民大醫院風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室，湖北恩施 445000；3.三峽大學醫學院腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北宜昌 443002)

三陰性乳腺癌泛指不表達或低表達雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體-2(HER-2)的一類乳腺癌[1]。盡管三陰性乳腺癌僅占臨床乳腺癌病例的15%～20%，但相比其他類型，三陰性乳腺癌侵襲能力強，常伴有遠處多發腫瘤轉移，因而患者預后差。近年來，多種針對ER或HER-2靶點的抗乳腺癌小分子藥物和抗體如他莫昔芬、拉帕替尼、曲妥珠單抗等顯示了臨床治療乳腺癌的效果[2-3]。但三陰性乳腺癌不表達或低表達上述受體，對上述靶向治療不敏感，目前仍亟需除化療以外的抗三陰性乳腺癌藥物和治療方法。信號通路蛋白Akt，即蛋白激酶B在多種腫瘤發生發展過程中發揮重要作用，已成為重要的抗腫瘤治療靶點[4]。研究表明，Akt可通過其激酶活性介導PI3K-Akt-mTOR信號通路過度活化，促進三陰性乳腺癌的發生發展，是治療三陰性乳腺癌的靶點[5]。目前已開發了多種Akt激酶抑制劑，如MK-2206、Afuresertib和厚樸酚等用于臨床抗腫瘤治療研究[6-8]。其中，MK-2206是一種口服有效的變構 Akt 抑制劑,目前已進入Ⅱ期臨床抗腫瘤研究。有研究表明，MK-2206能有效逆轉乳腺癌細胞系MCF-7對阿霉素的耐藥性[9]。鑒于Akt在三陰性乳腺癌發生發展中的重要作用，本研究使用Akt抑制劑MK-2206與三陰性乳腺癌臨床一線化療藥物順鉑聯合用于抗MDA-MB-468細胞增殖作用研究，以評價抑制Akt活性對順鉑抗三陰性乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 人三陰性乳腺癌細胞系MDA-MB-468購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。DMEM細胞培養基購自Gibico公司，胎牛血清購自天津灝洋公司。質粒pCMV-3tag6-ac-Akt和其對照質粒載體pCMV-3tag6為北京協和醫學院董文吉教授饋贈，并經上海生工公司DNA測序驗證。MK-2206、CCK-8試劑盒購自MCE公司、順鉑購自Sigma公司， BCA試劑盒、AnnexinV/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自Thermo公司。抗人Bax、Bcl-2、Cytochrome C和抗人β-actin(C4)購自Santa Cruz 公司。抗人Akt、pSer473 Akt、pThr308 Akt購自Cell Signaling Technology公司。辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠和羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1CCK-8法細胞增殖檢測 細胞傳代于96孔細胞培養板(1×103個/孔)，16 h后以0～50 μmol/L梯度濃度MK-2206和0～10 mol/L梯度濃度順鉑分別處理MDA-MB-468細胞24、48 h。對照組加入等體積二甲基亞砜(DMSO)，以不加入CCK-8試劑的細胞對照組為空白組。達藥物處理指定時間點后，棄去細胞培養基、每孔加入100 μL含CCK-8試劑的細胞培養基，繼續培養3 h。使用全波長酶標分析儀檢測450 nm波長的光密度(OD)值，并以如下計算公式計算細胞存活率，使用CompuSyn2.0軟件計算半數抑制濃度(IC50)。

細胞存活率(%) =[(藥物處理組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%

1.2.2Western blot分析蛋白表達 4 ℃預冷的RIPA全細胞裂解液加入蛋白酶抑制劑cocktail后重懸細胞，放置于混旋儀上4 ℃裂解15 min。然后以10 000×g離心10 min，分離細胞裂解液上清液，以BCA法測定其總蛋白含量。然后加入上樣緩沖液并于100 ℃孵育5 min后完成樣品制備。樣本以總蛋白25 g/孔上樣后經10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(250 mA,2.5 h)至硝酸纖維素膜。然后以TBST (20 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,0.05% Tween-20,pH 7.4)溶液配制的5%脫脂奶粉溶液對硝酸纖維素膜室溫封閉1 h，再分別加一抗 (Cytochrome C 1∶3 000，Bax 1∶1 000，Bcl-2 1∶1 000，β-actin 1∶3 000,Akt 1∶1 000,pSer473 Akt 1∶1 000,pThr308 Akt 1∶1 000。以含1%小牛血清清蛋白TBST溶液稀釋)于4 ℃共孵育16 h洗滌后與辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000,TBST溶液稀釋)于室溫孵育1 h，最后加入ECL試劑，使用Bioshine顯影儀(上海歐翔科學儀器有限公司)顯影。β-actin為樣品內參照。

1.2.3Annexin V/PI 雙染法分析細胞凋亡 傳代細胞至6孔板(2×105個/孔)，16 h后以2 mol/L MK-2206與0.5 mol/L順鉑分別或聯合處理MDA-MB-468細胞24 h后以胰酶消化，加入磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)重懸成單個細胞懸液。按照試劑盒操作步驟進行PI和Annexin V標記，以流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)檢測。

1.2.4線粒體裂解液和細胞質裂解液的制備 本實驗中使用預冷的細胞裂解液500 μL于冰上裂解1×106個細胞15 min，使細胞膜裂解而保留線粒體膜和細胞核膜完整，然后于1 000 r/min、4 ℃離心10 min將細胞核與線粒體組分和細胞質分離。再收集上清液于12 000 r/min、4 ℃離心15 min沉淀線粒體，離心所得上清液為細胞質。然后使用200 μL線粒體裂解液[10 mmol/L Tris(pH 7.4),150 mmol/L NaCl,1% Triton X-100,5 mmol/L EDTA(pH 8.0)，臨用前加入蛋白酶抑制劑cocktail]于4 ℃裂解15 min，獲得線粒體蛋白裂解液。

1.2.5質粒轉染 傳代2×105個細胞于6孔細胞培養板并持續培養16 h使細胞生長至80%融合，取質粒pCMV-3tag6-ac-Akt(隨過表達組)和其對照質粒載體pCMV-3tag6(空白組)以Lipofectamine2000TM試劑進行細胞轉染，實驗中每孔細胞取2 g質粒和4 L Lipofectamine2000TM,按照生產商提供的操作步驟實施。轉染36 h后，進行相應藥物處理或制備細胞裂解液進行蛋白表達分析。

1.2.6細胞增殖的藥物協同作用分析 細胞接種于96孔細胞培養板(1×104個/孔)、繼續培養16 h使細胞生長至80%融合，同時加入順鉑和MK-2206(終濃度為0、0.1 μmol/L順鉑+0.1 μmol/L MK-2206、0.25 μmol/L順鉑+0.25 μmol/L MK-2206、0.5 μmol/L順鉑+0.5 μmol/L MK-2206、1 μmol/L順鉑+1 μmol/L MK-2206、2 μmol/L順鉑+2 μmol/L MK-2206、5 μmol/L順鉑+5 μmol/L MK-2206)，每個藥物濃度設3個復孔。24 h后，以前述CCK-8法進行細胞增殖檢測。按照Chou-Talalay中位效應與聯合指數模型進行順鉑和MK-2206聯合效應分析[10-11]，實驗數據以CompuSyn 2.0軟件進行藥物聯合作用分析，兩藥物的聯合指數(combination index,CI)<1為協同效應。

2 結 果

2.1MK-2206抑制MDA-MB-468細胞增殖 MK-2206和順鉑均能夠以濃度和時間依賴性的方式顯著抑制MDA-MB-468細胞增殖，其中MK-2206的24 h IC50為11.23 μmol/L、順鉑的24 h半數抑制濃度為1.35 μmol/L，見圖1。

a:P<0.05,b：P<0.01，與未添加MK-2206或順鉑時比較

圖1 MK-2206和順鉑對MDA-MB-468細胞增殖的影響

2.2MK-2206通過抑制Akt磷酸化促進順鉑抑制MDA-MB-468細胞增殖 2、5 μmol/L MK-2206均可顯著抑制細胞內Akt Thr308和Ser473的磷酸化(圖2A)；而過表達組活化的Akt可顯著拮抗順鉑對MDA-MB-468細胞的增殖抑制作用,與空白組相比，過表達組Akt的過表達使順鉑對MDA-MB-468細胞的IC50從1.12 μmol/L提高到1.75 μmol/L(圖2B、C)。2 μmol/L MK-2206與0～10 μmol/L梯度濃度順鉑聯合應用可促進順鉑對MDA-MB-468細胞的增殖抑制；但過表達組活化的Akt 可部分抵消MK-2206對順鉑抑制MDA-MB-468細胞增殖的促進作用(圖2D)。

A、B：Western blot檢測細胞內Akt磷酸化水平；C：CCK-8法檢測過表達組成性激活Akt對順鉑抑制MDA-MB-468細胞增殖作用的影響；D：CCK-8法檢測過表達組成性激活Akt對順鉑單獨或聯合2 μmol/L MK-2206抑制MDA-MB-468細胞增殖作用的影響。a:P<0.05,b：P<0.01

圖2 MK-2206與順鉑聯合應用對MDA-MB-468細胞增殖的影響

2.3MK-2206促進順鉑誘導的MDA-MB-468細胞凋亡 AnnexinV/PI檢測結果顯示，2 μmol/L MK-220不能誘導MDA-MB-468細胞凋亡，但可顯著促進0.5 μmol/L順鉑誘導的細胞凋亡(圖3A)。Western blot結果表明，2 μmol/L MK-2206與0.5 μmol/L順鉑聯合處理導致MDA-MB-468細胞內Bax蛋白和細胞質細胞色素C表達顯著上升，而Bcl-2蛋白和線粒體細胞色素C表達顯著下調(圖3B)。

2.4MK-2206與順鉑協同抑制MDA-MB-468細胞增殖 MK-2206與順鉑的半數有郊劑量(50% effective dose，ED50)、ED75和ED90時的CI值分別為0.65±0.05、0.64±0.07 和0.63±0.08 ，均小于1，見圖4。

A：Annexin V/PI雙染法進行細胞凋亡分析;B：Western blot檢測MDA-MB-468細胞內Bcl-2、Bax蛋白表達和細胞質、細胞線粒體內細胞色素C水平

圖3 MK-2206和順鉑聯合應用對MDA-MB-468細胞凋亡及凋亡相關蛋白的影響

A：MK-2206和順鉑在ED50、ED75和ED90時的CI；B：MK-2206和順鉑聯合應用的CI值分布圖(CompuSyn2.0軟件分析)

圖4 MK-2206和順鉑聯合應用抑制MDA-MB-468細胞增殖的協同效應分析

3 討 論

大量研究表明，Akt作為一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶在腫瘤細胞信號轉導中發揮重要作用，其可通過下游信號蛋白分子mTOR、P21等調控細胞增殖、凋亡自噬和能量代謝，是近年來抗腫瘤研究的重要靶點[11]。如前所述，Akt蛋白激酶的過度活化也是導致三陰性乳腺癌發生發展的重要因素。2016年以來，MA等[12]將Akt抑制劑MK-2206與雌激素受體抑制劑fulvestrant聯合用于ER陽性和Her-2陰性乳腺癌的臨床研究，發現可有效促進fulvestrant誘導的ER陽性和Her-2陰性乳腺癌細胞凋亡，但將MK-2206與芳香化酶抑制劑Anastrozole聯合用于ER陽性和Her-2陰性乳腺癌臨床研究并未取得良好的治療效果[13]。

順鉑是目前臨床廣泛應用的基礎抗三陰性乳腺癌化療藥物之一，但毒副作用較大且長期應用易導致化療抵抗效應產生[14]。本研究首先觀察了MK-2206對人三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞增殖的影響，結果發現，MK-2206能夠抑制人三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞增殖，同時較低濃度(2 μmol/L)MK-2206可顯著抑制Akt磷酸化水平并顯著促進順鉑對MDA-MB-468細胞的增殖抑制作用。

研究表明，Akt激酶活化時發生473位絲氨酸和308蘇氨酸磷酸化，而通過將這兩個位點的氨基酸突變成天冬氨酸能夠模擬Akt磷酸化，從而獲得組成性活化的Akt用于其功能研究[15]。為分析MK-2206是否通過抑制Akt磷酸化發揮作用，實驗中在MDA-MB-468細胞中過表達組成性活化的Akt，然后首先檢測了Akt磷酸化對順鉑抗細胞增殖作用的影響，結果發現表達組成性活化的Akt可將順鉑對MDA-MB-468細胞的IC50上調，拮抗其對MDA-MB-468細胞的增殖抑制作用。進一步以2 μmol/L MK-2206與順鉑聯合應用發現，MK-2206能夠促進順鉑對人三陰性乳腺癌MDA-MB-468細胞的增殖抑制作用，但過表達組成性活化的Akt可部分逆轉這一作用。這一結果表明，MK-2206通過抑制Akt磷酸化促進順鉑對MDA-MB-468細胞的增殖抑制。

AnnexinV/PI細胞凋亡分析發現，2 μmol/L MK-2206不能誘導MDA-MB-468細胞凋亡，但能夠顯著促進順鉑誘導的MDA-MB-468細胞凋亡。通過進一步檢測MDA-MB-468細胞內凋亡相關基因發現，MK-2206能夠顯著促進順鉑誘導的Bax蛋白表達下調和Bcl-2蛋白表達上調，同時其也促進了順鉑誘導的線粒體膜內側細胞色素C發生細胞質轉移。由于Akt激酶活性過度活化是腫瘤細胞拮抗細胞凋亡的重要因素，MK-2206抑制Akt激酶磷酸化是其促進順鉑誘導細胞凋亡的主要原因。進一步進行藥物聯合效應分析顯示，MK-2206和順鉑能夠在較低的作用濃度下(ED50)顯示出抗MDA-MB-468細胞增殖的藥物協同作用。這一結果提示，使用MK-2206抑制Akt有望降低順鉑抗三陰性乳腺癌治療的有效濃度，從而減少順鉑的毒副作用和化療耐藥的發生。

綜上所述， MK-2206通過抑制Akt激酶促進順鉑誘導的線粒體途徑細胞凋亡，并與順鉑通過藥物協同作用抑制MDA-MB-468細胞增殖。上述研究表明，MK-2206與順鉑聯合應用具有潛在的抗三陰性乳腺癌臨床應用價值。