小鼠早期胚胎CSD基因及牛磺酸的表達研究*

范晶晶，李 煒，呂釗旭，馮永珍，鄭秋闿

(1.濰坊學院生物與農業工程學院，山東濰坊 261061；2.山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室，山東濰坊 261061；3.濰坊護理職業學院內科教研室，山東濰坊261041；4.山東省濰坊市婦幼保健院新生兒科 261000；5.濰坊學院校醫院護理部，山東濰坊 261061；6.濰坊學院化學化工與環境工程學院，山東濰坊 261061)

半胱亞磺酸脫羧酶(cysteine sulfinate decarboxylase,CSD)對底物半胱亞磺酸具有較高親和性，是?；撬岷铣傻南匏倜竅1]。在哺乳動物體內牛磺酸合成的第一步是由蛋氨酸和半胱氨酸經代謝產生半胱亞磺酸，然后半胱亞磺酸經過CSD的脫羧作用形成亞?；撬幔俳浹趸罱K生成牛磺酸[2]。研究發現?；撬崾禽斅压芤褐兴阶罡叩挠坞x氨基酸，在小鼠輸卵管液中可達到6.64 μmol/L，能占總游離氨基酸的59%[3]，在妊娠第二天大鼠輸卵管液中濃度達101.8 μmol/L[4]。輸卵管是胚胎早期發育的主要場所，許多研究結果已證實?；撬岽_實參與調節胚胎的發育和胚胎的著床。在培養液中添加一定量的牛磺酸能促進小鼠、大鼠、兔、牛和人等多種動物胚胎的體外發育[4-8]。但是目前早期胚胎是否表達CSD，胚胎能否通過CSD的作用來自身合成?；撬釢M足發育的需要，至今仍無詳細的研究。因此，本實驗采用反轉錄PCR(RT-PCR)、免疫熒光染色的方法，研究分析?；撬?、CSD基因及蛋白在小鼠早期胚胎中的表達情況，進而為CSD和牛磺酸在胚胎早期發育功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 10周齡雌、雄昆明(KM)品系小鼠(購自青島市實驗動物中心，SCXK(魯)20130010)，自由飲水采食，溫度控制在22～26 ℃，14 h光照，10 h黑暗。小鼠超數排卵和早期各發育階段胚胎的收集方法按照范晶晶[9]的描述進行。Trizol RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)，M-MLV 反轉錄試劑盒(美國Promega公司)，孕馬血清激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG，寧波第二激素廠)，FITC標記鏈霉親和素(SP-FITC，美國Southern Biotech公司)，生物素標記羊抗兔IgG(GARB)、FITC標記山羊抗兔IgG(GAR-FITC，Zymed公司)，?；撬嵋豢?德國Merck公司)，CSD一抗是由法國TAPPAZ教授(Directeur de Recherche CNRS,INSERM U 433,法國)贈送。其余試劑購自美國Sigma公司。主要儀器有高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，凝膠成像系統(美國Alpha Imager公司)，TE2000-E激光共聚焦掃描顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2RT-PCR 分別收集各發育時期100枚胚胎于500 μL的Trizol RNA裂解液中，按照說明書步驟提取總RNA，進行反轉錄。取3 μL反轉錄產物加至PCR反應體系中，引物各1 μL，10×buffer 5 μL，dNTP 4 μL，Taq酶1 μL，H2O 35 μL，反應總體積為50 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35個循環；循環結束后72 ℃ 10 min。CSD上游引物為5′-GTT TGG GAT TGT TGT AGA TGA-3′，下游引物為5′-GTG TAC TGG CTA GTG TTG AGG-3′，預計擴增片段長度為279 bp(登錄號 NM_144942)。β-肌動蛋白(β-actin)作為內參，上游引物為5′-ATG AGG TAG TCT GTC AGG T-3′，下游引物為5′-ATG GAT GAC GAT ATC GCT-3′，預計擴增片段長度為569 bp(登錄號X03672)。擴增PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，Alpha Imager凝膠成像系統拍照分析，Alpha Imager 2200 軟件分析PCR電泳條帶的光密度值。

1.3免疫熒光染色 取2-細胞、4-細胞、8-細胞、桑椹胚、囊胚期胚胎用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，然后轉移到載玻片上，晾干后迅速用-20 ℃預冷的固定液(甲醇∶丙酮=1∶1)固定30 min。封閉液(0.2%Triton X-100、10%正常羊血清的PBS)封閉2 h，加入CSD一抗(1∶1 000)在4 ℃下孵育過夜。次日PBS洗3次，每次5 min，加入GARB(1∶200)在常溫下育孵2 h，然后用PBS洗滌，加入SP-FITC(1∶50)常溫下孵育2 h，再用上述方法進行洗滌，用Hoechst33342復染2 min。另外一部分固定好的胚胎封閉后加入?；撬嵋豢?1∶1 000)，4 ℃下孵育過夜，加入GAR-FITC(1∶200)在常溫下育孵2 h，加入碘化丙啶(PI)(1∶200)復染2 min，用1,4-二疊氮雙環[2.2.2]辛烷(DABCO)封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。

2 結 果

2.1RT-PCR結果 CSD mRNA在2-細胞、4-細胞、8-細胞、桑葚胚、囊胚期的RT-PCR檢測結果顯示，著床前不同時期小鼠胚胎都有CSD mRNA的表達，擴增的PCR產物與預期的大小一致，約279 bp，β-actin約569 bp。CSD mRNA在小鼠著床前胚胎中的相對表達強度顯示，胚胎從2-細胞期開始到囊胚期CSD mRNA表達量呈逐漸升高趨勢，桑葚胚表達量急劇升高，囊胚期達到最高值。見圖1。

A：PCR凝膠電泳圖；B：PCR分析圖。1:DNA分子標記物;2:2-細胞期;3:4-細胞期;4:8-細胞期;5:桑葚胚期;6:囊胚期；a:P<0.95，與2-細胞期比較；b:P<0.05,與4-細胞期比較；c:P<0.05,與8-細胞期比較；d:P<0.05,與桑葚胚期比較

圖1 RT-PCR檢測CSD mRNA在早期胚胎

發育各階段的表達

圖2 CSD蛋白在小鼠早期胚胎發育各階段的表達(免疫熒光染色)

A:2-細胞期;B:4-細胞期;C:8-細胞期;D:桑葚胚期;E:囊胚期

圖3?；撬嵩谛∈笤缙谂咛グl育各階段的表達(免疫熒光染色)

2.2免疫熒光染色結果 CSD蛋白免疫熒光染色結果顯示，從2-細胞至囊胚期均呈陽性綠色熒光，熒光亮度逐漸增強。CSD均勻分布在卵裂球細胞質中，晚期囊胚的內細胞團和滋養層細胞都為陽性著色，透明帶無著色，見圖2。?；撬崦庖邿晒馊旧Y果顯示，從2-細胞期至囊胚期的整個發育過程細胞質均呈陽性綠色熒光，透明帶無陽性，見圖3。

3 討 論

小鼠妊娠期短、繁殖力強多被用來研究胚胎的發育。哺乳動物早期胚胎發育是一個復雜有序的調控過程，任何因素異常都有可能導致發育失敗[10]。牛磺酸是調節機體多個系統功能的重要活性物質[11-12]。近年研究發現在雌性動物生殖系統含量豐富，對胚胎的生長發育具有重要的促進作用[13]。例如可提高受精卵的發育速度[4]，顯著提高胚胎2-細胞率、囊胚率、囊胚總細胞數[5,14]。?；撬岽龠M胚胎發育的機制主要有：(1)調節滲透壓穩定細胞膜[15]；(2)可以抑制氧化性毒素物質的產生，并通過調節線粒體活性起到抗氧化作用[16]；(3)有類胰島素樣作用，能促進細胞增殖[17]；(4)可以抑制Na+，K+-ATP酶活性，避免細胞內K+水平異常升高所造成胚胎的損傷等[18]。

CSD在嚙齒類動物體內的活性較高，其自身合成的?；撬嶙阋詽M足生理需要。CSD基因敲除后，第二代(G2)小鼠大部分在出生后24 h死亡，給G2代鼠飲水中飼喂牛磺酸可以使G3代鼠的成活率從15%提高到92%[19]。李建華[20]報道在小鼠輸卵管上皮細胞中有CSD的表達，并且在輸卵管上皮細胞也檢測到了牛磺酸[21]，說明輸卵管上皮細胞可以通過CSD途徑合成并分泌?；撬岬捷斅压芤褐?，從而調節早期胚胎的發育。KIM等[12]也報道，在ICR品系小鼠4.5、10.5、15.5、18.5 d胚胎中都能檢測到CSD mRNA的表達。另外，對小鼠卵巢進行CSD免疫組織化學染色，結果發現從初級卵泡到三級卵泡的卵母細胞都有CSD蛋白表達[20]。本研究結果發現從小鼠2-細胞開始一直到囊胚的整個發育過程都能檢測到CSD的表達，說明胚胎自身也可以通過CSD來合成?；撬帷＝Y果提示著床前后胚胎中?；撬岵粌H可以由輸卵管液提供，也可以通過自身來合成一部分?；撬?。同時早期胚胎也一直有?；撬岜磉_，說明牛磺酸確實參與了胚胎的卵裂、細胞的發育和分化過程。