Luminex法檢測腎移植受者體內抗HLA抗體的方法學分析*

劉 偉，李代紅，宋廣平

(天津市第一中心醫院輸血科 300192)

腎移植是目前臨床上治療腎臟器官功能喪失最有效的治療手段。國內外研究表明，腎移植前對受者抗人類組織相容性抗原(HLA)抗體進行監測，對預測移植風險、避免排斥反應的發生等具有重要意義[1]。

表1 兩種方法檢測抗HLA、HLA-Ⅰ類、HLA-Ⅱ類抗體陽性情況

當受者體內存在抗HLA抗體，特別是供者特異性抗體時，若移植前能夠及時檢測出此類抗體，在選擇供體上可避開具有相應抗原的供者，則可避免潛在的免疫反應發生。而在腎移植后出現抗HLA抗體，則大多會發生排斥反應，如果治療延緩則可導致移植失敗[2-3]。

隨著抗HLA抗體檢測方法靈敏度和特異性的進一步提高，移植受者體內抗HLA抗體的檢出率上升到95%，其檢測技術的進步對腎移植臨床的診斷和治療具有更強的指導意義[4-5]。本研究通過比較Luminex技術和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)兩種方法對腎移植受者血清中抗HLA抗體的檢測差異并分析其與移植術后排斥反應的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年1-10月在本院接受腎移植的患者120例，其中男78例，女42例，平均年齡(44.0±7.5)歲。所有腎移植供受者ABO血型相同，術前淋巴細胞毒試驗均小于10%。術后常規采用環孢素A(他克莫司)+嗎替麥考酸酯+潑尼松三聯免疫抑制方案治療。

1.2試劑與儀器 HLA抗體篩查試劑盒和HLA抗體確定試劑盒由美國One Lambda 公司生產；Lifecodes LMX試劑盒和Lifecodes LSA單抗(Ⅰ+Ⅱ)試劑盒由美國Immucor公司提供。洗板機和酶標儀由Bio-RAD公司提供；Luminex 200由美國Luminex公司提供。

1.3方法

1.3.1Luminex技術檢測 將20.00 μL洗液、2.50 μL熒光微球和6.25 μL待檢血清加入到96孔板中，蓋上封板膜，用錫箔紙包嚴反應板，室溫振蕩孵育30 min。然后每反應孔加入50 μL洗液，洗后用真空泵抽掉洗液，每孔加入120 μL洗液，洗滌3次，洗后用真空泵抽掉洗液。然后，每孔加25 μL稀釋的二抗，用錫紙包嚴反應板，室溫振蕩孵育30 min。每孔加100 μL Wash Buffer，小心混勻重懸微珠。上Luminex200平臺獲取特異性結合微球的熒光信號，再利用MATCH IT Antibody分析軟件分析得到特異性抗原的類型。檢測抗HLA抗體的強度以平均熒光強度表示，可分為強陽性、中陽性和弱陽性3個危險度分層。

1.3.2ELISA法檢測 在Lambda抗原板相應孔中加已稀釋的10 μL標本與質控血清，室溫放置1 h。加15～20 μL 稀釋好的洗液，輕輕混勻，反復洗滌3次，然后在Lambda抗原板所有孔中加10 μL酶標二抗，室溫放置40 min，洗滌3次。然后加入10 μL混合的底物液，室溫放置10～15 min。最后加入5 μL終止液，15 min后上酶標儀檢測其光密度(OD)值。

1.4排斥反應的診斷 根據受者的病史、臨床癥狀及體征、實驗室檢查指標、彩色多普勒超聲檢查結果，移植腎病理結果及抗排斥反應治療的效果等進行綜合評價。

2 結 果

2.1兩種方法檢測抗HLA抗體的陽性率比較 在120例腎移植患者的血清樣本中，Luminex技術抗HLA抗體陽性(Ⅰ類陽性且/或Ⅱ類陽性)血清樣本51例，占總數的42.5%；ELISA法抗HLA抗體陽性(Ⅰ類陽性且/或Ⅱ類陽性)血清樣本20例，占總數的16.7%。Luminex技術抗HLA抗體陽性檢出率明顯高于ELISA法(P<0.05)。Luminex技術檢測抗HLA-Ⅰ類抗體陽性為25例，占總數的20.8%，ELISA法檢測抗HLA-Ⅰ類抗體陽性為10例，占總數的8.3%，兩種方法檢測抗HLA-Ⅰ類抗體結果的符合率為40%。Luminex技術檢測抗HLA-Ⅱ類抗體陽性為39例，占總數的32.5%，ELISA法檢測抗HLA-Ⅱ類抗體陽性為18例，占總數的15%，兩種方法檢測抗HLA-Ⅱ類抗體結果的符合率為46%。兩種方法所測結果差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2兩種方法檢測抗HLA抗體結果與排斥反應的關系 120例腎移植受者中，術后有17例發生排斥反應(14.2%)。Luminex技術檢測結果顯示：51例術前抗HLA抗體陽性者有12例術后發生排斥反應(占23.5%)，69例術前抗HLA抗體陰性者有5例術后發生排斥反應(占7.2%)，按照平均熒光強度分析，抗HLA抗體滴度強陽性10例，中陽性7例術后出現移植腎功能異常。用ELISA法檢測20例術前抗HLA抗體陽性者有3例術后發生排斥反應(占15.0%)，100例術前抗HLA抗體陰性者有14例術后發生排斥反應(占14.2%)，按照OD值分析，抗HLA抗體滴度強陽性5例，中陽性12例術后出現移植腎功能異常。兩種方法檢測的抗體陽性中排斥反應發生率差異有統計學意義(P<0.05)，兩種方法檢測的抗體陰性中排斥反應發生率，差異也有統計學意義(P<0.05)。

3 討 論

近年來，通常把ELISA技術作為檢測抗HLA抗體的常規方法，但該方法只能檢測到血清學分型水平(例如DR1)，特異性不強，導致在腎臟移植供者篩選時部分合適供者漏選。此外，應用ELISA法檢測抗HLA抗體，操作繁瑣，耗時，多次洗板容易造成污染，導致假陽性結果的出現[6]。Luminex技術是繼人類基因組計劃完成后逐漸發展起來的集流式細胞技術、激光技術、數字信號處理技術及傳統化學技術為一體的新型生物分子檢測技術，其原理是在不同熒光編碼的聚苯乙烯微球上進行抗原-抗體、酶-底物、配體-受體的結合反應及核酸雜交反應、通過紅、綠兩束激光分別檢測微球編碼和報告熒光來達到定量和定性的目的。Luminex技術主要有以下優點[7-8]，(1)高通量：可以對同一樣本中的多種不同目的分子同時進行實時、定性、定量分析；(2)所需樣本量少：在同一個反應孔中可以同時完成100種不同的生物學反應，可以顯著地節約了標本用量；(3)靈敏度高：微球表面積大，每個微球可包被10萬個捕獲抗體，高密度的捕獲抗體保證了最大程度地與樣本中的抗原分子結合，提高檢測靈敏度；(4)準確性高：微球上的報告分子熒光強度與結合的待測分子成正比；(5)重復性好：相對于ELISA，Luminex技術液相芯片中的熒光讀值更加直接、穩定、靈敏，最終取熒光強度的中值作為結果；(6)自動化程度高：應用計算機軟件自動讀取數據和相應軟件分析結果，減少人為主觀判斷錯誤，增加了結果的準確性。

有文獻報道，Luminex技術靈敏度和特異度都遠遠高于以ELISA為代表的傳統檢測受者抗HLA抗體水平的技術[9]。本研究結果顯示在120例腎移植患者的血清標本中，Luminex技術抗HLA抗體陽性(Ⅰ類陽性且/或Ⅱ類陽性)血清樣本51例，占總數的42.5%；ELISA法抗HLA抗體陽性(Ⅰ類陽性且/或Ⅱ類陽性)血清樣本20例，占總數的16.7%。Luminex技術抗HLA抗體的陽性檢出率明顯高于ELISA法(P<0.05)。王慶華等[10]對34例親體腎移植受者進行兩種方法學的比較，證實Luminex技術檢測腎移植受者抗HLA抗體的陽性檢出率明顯高于ELISA法。

有研究證實，腎移植患者術前抗HLA抗體的存在與術后排斥反應的風險增加顯著相關[11]。本研究通過對120例腎移植受者移植前抗HLA抗體的檢測和移植后出現排斥反應的病例分析，發現120例腎移植受者中，術后有17例發生排斥反應(14.2%)。兩種方法檢測的抗HLA抗體陽性中排斥反應發生率差異有統計學意義(P<0.05)，兩種方法檢測的抗HLA抗體陰性中排斥反應發生率差異也有統計學意義(P<0.05)。由此可見，用Luminex技術檢測出的抗HLA抗體水平與排斥反應的發生具有更強的相關性，臨床預警效果更為明顯。

Luminex技術能夠更精確地判斷出抗HLA抗體陽性是否為抗供者特異性抗體(DSA)，便于篩選移植供體，有效地縮短了高致敏患者的等待時間，避免了供體的浪費，同時為急性排斥反應的診斷和治療提供了有力的技術支撐。近年來，有研究表明，供者特異性HLA-DP抗體能介導急、慢性排斥反應[12]。然而，ELISA法檢測HLA-Ⅱ類抗體中的HLA-DQ/DP抗體時常出現漏檢，而Luminex技術包被的單抗原微球位點遠多于ELISA法，增加了抗HLA抗體檢出的寬度。

總之，腎移植術前準確地檢測出受者的抗HLA抗體水平，判斷其HLA致敏狀態，對有效減少排斥反應的發生，提高移植成功率和移植物長期存活率具有重要的意義。同時有利于腎移植術后方案的調整，避免移植術前抗HLA抗體，減少抗體介導的排斥反應的發生風險，有利于改善受者的生活質量。