超高效液相色譜-串聯質譜法檢測食品中雞蛋過敏原卵白蛋白

寧亞維，劉 茁，范素芳，馬俊美，李 強,*，張 巖,*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050000）

食物過敏大多是食物中過敏原蛋白對機體細胞的選擇性刺激，從而引起機體免疫系統異常和生理機能障礙[1-2]，近年來已經成為國際關注的重大食品安全問題，其危害僅次于食源性微生物污染[3]，被世界衛生組織認為是21世紀的流行病[4]。

在食物過敏中，90%以上是由含麩質的谷物、甲殼類、魚類、蛋類、花生、大豆、乳和堅果及其制品8 種食物引起的[1]，其中雞蛋過敏的人群最為廣泛，特別是3歲以下的兒童為雞蛋過敏的易發人群[5]。目前，對于雞蛋過敏尚無有效的治療手段，過敏人群只能嚴格控制日常飲食不得含有過敏原，然而雞蛋營養豐富，在眾多食品中均有添加，過敏人群難免會受到傷害[2]。對此，國外已經出臺了強制性標識食品過敏原的法規[6]，而國內只有針對出口食品過敏源成分的標準，以實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法和環介導等溫擴增檢測方法為主，需要開發制定高靈敏度的直接對常見致敏蛋白的定性定量方法，并制定相應的標識法規。

目前用于過敏原檢測的手段主要有酶聯免疫（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）法[7-11]、PCR法[12-15]和液相色譜-質譜聯用技術[16-17]。ELISA法是基于蛋白質的檢測技術，是現在最為成熟的方法，但是由于各種加工手段使蛋白質存在不同程度的變性，導致無法與抗體準確結合，而且ELISA法不可避免存在交叉反應且通量低，因此不適于對雞蛋過敏原的準確定量[1,3]。PCR法是基于DNA水平的檢測手段，而非直接對致敏蛋白進行定量，但雞蛋含有極少量的DNA，并且雞蛋和雞肉中的DNA沒有差異性[3,12]。近年來，液相色譜-串聯質譜法廣受關注，其基于特征肽段有效地解決了變性蛋白的定量檢測問題，而且可以直接對蛋清致敏蛋白進行高靈敏度、特異性和準確度的檢測。此方面，Tolin等[18-19]通過液相色譜-串聯質譜法以卵白蛋白和溶菌酶作為主要致敏蛋白來表征葡萄酒中雞蛋源澄清劑的存在，同時與酶聯免疫點印跡化學發光法進行比較，檢出限降低了10 倍，可以實際應用于商業葡萄酒中微量動物源澄清劑的殘留檢測；Heick等[20]采用液相色譜-串聯三重四極桿質譜技術測定面包基質中的卵白蛋白，檢出限為42 μg/g，且線性范圍廣；Planque等[21-22]建立了超高效液相色譜-串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法測定巧克力、冰淇淋、番茄醬和餅干中的卵白蛋白，檢出限達到3.4 μg/g。

鑒于質譜檢測方法具有高靈敏度與特異性的優勢，本實驗擬通過UPLC-MS/MS技術建立雞蛋過敏原卵白蛋白的定量檢測方法，并進行線性關系、檢出限、加標回收等方法學驗證，將所建方法應用于實際商品中卵白蛋白的定量檢測，以期對食品中雞蛋過敏原的準確定量提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋，配料中分別含有雞蛋和不含雞蛋的餅干、掛面、蛋糕、面包 市售。

碳酸氫銨、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、卵白蛋白標準品（純度≥98%，來源于雞蛋清）、甲酸（色譜純）美國Sigma公司；乙腈、正己烷（均為色譜純）美國Fisher Scientific公司；胰蛋白酶 美國AB SCIEX公司；Watsons蒸餾水（實驗用水） 廣州屈臣氏食品飲料有限公司；蛋清過敏源卵白蛋白3 條特征肽段LTEWTSSNVMEER（LR-13）、GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）、ELINSWVESQTNGIIR（ER-16）（純度均不小于95%）由上海強耀生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設備

超濾離心管（0.5 mL，10 kDa）、Easy-nLC 1000納升液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜（配Nanospray Flex離子源） 美國Thermo Scientific公司；低蛋白吸附樣品瓶 美國Waters公司；Triple Quad 6500+液相色譜-質譜聯用儀（配電噴霧離子源及MultiQuant 3.0.1數據處理系統） 美國AB SCIEX公司；N-EVAPTM111氮吹儀 美國Organomation Associates公司；C18色譜柱（100 μm×4 cm，120 ?，5 μm）、C18毛細色譜柱（75 μm×15 cm，120 ?，5 μm） 北京樂潤峰科技有限公司；Proteonavi色譜柱（2.0 mm×150 mm，5 μm） 日本Shiseido公司。

1.3 方法

1.3.1 儲備液的配制

分別精密稱取LTEWTSSNVMEER（LR-13）、G G L E P I N F Q T A A D Q A R（G R-1 6）、ELINSWVESQTNGIIR（ER-16）各1 mg于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，配制成100 μg/mL的特征肽段混標儲備液。精密稱取20 mg卵白蛋白標準品（來源于雞蛋清）于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，配制成2 mg/mL的卵白蛋白標準品儲備液。

1.3.2 Easy-nLC 1000納升液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜測定條件

色譜條件：富集柱：C18色譜柱（100 μm×4 cm，1 2 0 ?，5 μ m）；分析柱：C18毛細色譜柱（75 μm×15 cm，120 ?，5 μm）；流速300 nL/min；進樣體積2 μL；流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈；洗脫程序：0～3 min，3%～7% B；3～38 min，7%～22% B；38～48 min， 22%～35% B；48～50 min，35%～90% B；50～60 min，90% B。

質譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；掃描模式：Full MS/dd-MS2；Full MS分辨率70 000；AGC target為1×106；質量掃描范圍m/z 350～1 800；dd-MS2分辨率17 500，AGC target為1×105；隔離窗口為m/z 2.0；Fixed fi rst mass為m/z 120.0；碰撞能為27 eV。

1.3.3 Triple Quad 6500+液相色譜-質譜聯用儀測定條件

色譜條件：Proteonavi色譜柱（2.0 mm×150 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進樣體積1 μL；流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈；洗脫程序：0～0.5 min，2% B；0.5～4.5 min，2%～50% B；4.5～7.5 min，50%～75% B；7.5～9 min，75% B；9～9.01 min；75%～2% B；9.01～11 min，2% B。

質譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；掃描模式：多反應監測；離子化電壓5 500 V；霧化器壓力（GS1）50 psi；輔助氣壓力（GS2）55 psi；氣簾氣壓力30 psi；離子源溫度500 ℃。

1.3.4 樣品預處理

食品基質分析前需要進行脫脂處理。稱取1 g至15 mL離心管中，加入5 mL正己烷后振蕩10 min后，9 500×g離心10 min棄去上清液；然后重復上述正己烷脫脂后，采用氮氣吹干，以備后續處理。

1.3.5 蛋白酶水解

稱取0.1 g脫脂樣品，用超純水稀釋至10 mL，取50 μL樣品稀釋液加入690 μL水混勻，再向其中加入10 μL的DTT（100 mmol/L）于70 ℃水浴反應30 min，然后加入10 μL的IAA（300 mmol/L）于室溫避光靜置30 min。向上述混合液中加入200 μL NH4HCO3（500 mmol/L）和30 μL胰蛋白酶（1 mg/mL）混勻，于37 ℃水浴振蕩酶解3 h，最后加入10 μL甲酸混勻以終止反應。酶解液13 000×g離心10 min，取500 μL上清液于10 kDa超濾離心管中，14 000×g離心20 min，去除雜蛋白，收集上清液待測。

1.3.6 基質效應

將配料不含雞蛋的餅干、掛面、蛋糕、面包作為空白基質，精密移取一定量的特征肽段GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）儲備液，分別用水和空白基質提取液稀釋配制成2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL標準曲線溶液。基質效應按下式計算：

式中：slopematrix為空白基質曲線的斜率；slopestandard為標準曲線的斜率。

1.3.7 加標回收率

向空白樣品中添加卵白蛋白標準品儲備液進行回收率測定，其中卵白蛋白的具體添加量按照特征肽段GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）的2、10、20 倍定量限3 個水平計算得出（卵白蛋白與GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）的物質的量比為1）。為排除基質對卵白蛋白定量產生的影響，所有標準曲線均采用每種樣品對應的空白樣品基質提取液進行配制。

2 結果與分析

2.1 特征肽段的篩選

雞蛋中蛋白質豐富，蛋清中卵類黏蛋白、卵白蛋白、卵轉鐵蛋白和溶菌酶被公認為主要的致敏蛋白[23]。卵類黏蛋白熱穩定性較高，對胰蛋白酶有抑制作用，不易達到肽段水平的分析檢測；卵轉鐵蛋白和溶菌酶對熱不穩定易變性，目前研究較少。而卵白蛋白在蛋清中含量最高，由386 個氨基酸組成，分子質量為44 287 Da，主要引起免疫球蛋白IgE介導型過敏反應，且不耐酶解，研究最為廣泛[23-25]。因此，雞蛋中卵白蛋白的定性定量分析成為雞蛋過敏原檢測的主要依據[18-22,26]。

特征肽段的篩選可為方法的建立提供定量依據，因此本研究首先篩選卵白蛋白中的特征肽段。將前處理后的樣品直接注入Easy-nLC 1000納升液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜進行分離分析，將所得的肽段信息利用ProteinPilot軟件和Uniprot數據庫分析處理。與Uniprot數據庫結果比對后，得到多條肽段。然后根據如下特征肽段的篩選原則進行特征肽段的篩選：以7～20 個氨基酸為宜；不含錯切或漏切的酶切位點；最好不含甲硫氨酸；具有穩定的物理化學性質；進行定性定量分析時，具有較好的靈敏度和峰形[20,27-30]。最終篩選到3 段響應值較好、靈敏度較高的特征肽段，分別為LTEWTSSNVMEER（LR-13）、GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）、ELINSWVESQTNGIIR（ER-16）。所選擇的3 條肽段通過Uniprot數據庫進行BLAST搜索，確定肽段的唯一性。參考Zhang Jingyun等[31]的方法，合成上述3條特征肽段的純品作為標準樣品，進行后續研究。

2.2 流動相及多反應監測參數優化

實驗比較了乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸溶液2 種流動相體系在相同的洗脫程序條件下特征肽段的響應和出峰情況。結果表明，使用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相，特征肽段的響應和峰形都要優于前者，拖尾現象明顯改善，穩定性也有所提高。在電噴霧離子源正離子模式下，加入甲酸有助于肽類物質離子化進而提高分離效率和質譜信號的強度，故選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相。

將3 段特征肽段標準品分別用水稀釋至5 000 ng/mL，通過蠕動泵以5 μL/min的速率直接注入Triple Quad 6500+質譜儀中，以全掃描模式確定特征肽段的準確母離子質量數。3 條肽段均以[M+2H]2+作為母離子，分別再對3 個母離子進行二級掃描，確定各自的定性和定量離子。每個肽段選取3 個子離子，對子離子的破碎電壓、碰撞能量等參數進行優化如表1、圖1所示。

表1 過敏原卵白蛋白的合成特征肽段的多反應監測參數Table 1 MRM parameters of synthetic characteristic peptides of allergen ovalbumin

圖1 卵白蛋白3 條特征肽的色譜圖（5 000 ng/mL）Fig. 1 Chromatogram of three characteristic peptides of ovalbumin (5 000 ng/mL)

2.3 方法的線性關系、LOD和LOQ結果

分別精密移取混標儲備液，用水稀釋配制成1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL的標準溶液，分別以3 條特征肽段的色譜峰面積為縱坐標（Y），以各組分的質量濃度為橫坐標（X）做線性回歸方程，并計算該方法的線性范圍。

在不含雞蛋的空白基質中，添加混標儲備液，獲得每個肽段RSN為3時，作為該肽段的檢出限（limit of detection，LOD）；每個肽段RSN為10時，作為該肽段的定量限（limit of quantity，LOQ）。由表2可以看出，在所篩選的3 條特征肽段中GGLEPINFQTAADQAR（G R-1 6）的靈敏度最高且圖1表明其響應值最好，故選取GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）作為定量肽段，其余2 條肽段用以輔助定性分析。

表2 卵白蛋白中特征肽段的線性關系、LOD和LOQ（n=6）Table 2 Linear relationships, LODs and LOQs of characteristic peptides of allergen ovalbumin (n= 6)

2.4 基質效應的評價

圖2 溶劑與空白基質的標準曲線Fig. 2 Standard curves with water and six blank solvents

檢測6 種空白基質的基質效應，結果如圖2所示。基質效應大于100%時，表明基質對目標物離子化有增益作用；基質效應小于100%時，表明基質對目標物離子化有抑制作用。結果表明，餅干（95.05%）、面包（90.68%）、掛面（88.53%）對特征肽段GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）有不同程度的減弱作用，其中掛面的離子化抑制程度最大；而蛋糕基質（112.60%）對特征肽段GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）有增益作用。因此，后續實驗采用基質配標來定量以補償基質效應。

2.5 加標回收率測定結果

表3 基質中卵白蛋白的加標回收率和RSD（n=6）Table 3 Spiked recoveries and RSDs of ovalbumin in different matrices (n= 6)

如表3所示，卵白蛋白中定量肽段GGLEPINFQTAADQAR（GR-16）在基質餅干1中回收率在83.32%～95.66%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）不大于9.97%；在基質餅干2中回收率在80.76%～98.55%之間，RSD不大于8.59%；在基質掛面中回收率在77.22%～92.68%之間，RSD不大于5.13%；在基質蛋糕1中回收率在82.47%～86.56%之間，RSD不大于4.88%；在基質蛋糕2中回收率在79.41%～82.58%之間，RSD不大于8.31%；在基質面包中回收率在85.13%～91.36%之間，RSD不大于6.30%。

2.6 實際樣品的檢測結果

采用市售餅干、蛋糕、面包、掛面（配料表含雞蛋）作為實際樣品進行檢測。分別采用4 種樣品的空白基質配制標準曲線，結果見表4。

表4 UPLC-MS/MS檢測市售食品中卵白蛋白含量（n=6）Table 4 Determination of valbumin in commercial foods by UPLC-MS/MS (n= 6)

3 結 論

本實驗建立UPLC-MS/MS法快速檢測食品中雞蛋過敏原卵白蛋白的方法。通過蛋白質組學方法成功篩選到高特異性卵白蛋白肽段，并采用電噴霧質譜多反應監測模式實現了高靈敏度、快速定量。該方法的建立為食品中雞蛋過敏原的檢測提供了技術支持，為推動我國食品過敏原標識的監督與立法提供理論支持。