平菇栽培及平菇中酪氨酸酶活力抑制的動力學研究

陳駿穎　馮學軍　羅子皓　吳江維　焦元紅　楊裕啟

摘 要 本實驗前期對平菇進行栽培，中期對平菇中酪氨酸酶提取和純化，后期對得到的氨酸酶進行活性抑制的動力學研究。用紫外分光光度計檢測不同pH、溫度、抑制劑下酶活力，實驗結果表明： pH值為6.8，溫度為30℃時，平菇中酪氨酸酶催化活力最大，其中0.3mmol/L的L-半胱氨酸對酪氨酸酶有較好的活力抑制作用，且L-半胱氨酸對酪氨酸酶的抑制類型為不可逆競爭性。

關鍵詞 平菇 酪氨酸酶 褐變 催化活力 抑制作用 動力學

中圖分類號：Q939 文獻標識碼：A

平菇是一種可食用的植物門側耳真菌。平菇栽培有著可觀的經濟效益，但由于平菇組織細胞中含有大量水，平菇表面保水能力又較弱，室溫下采摘后若不經過處理，平菇菇體1-2天便會大量失水，菌蓋收縮，菌體發生明顯褐變。催化平菇發生褐變的酶是酪氨酸酶（PPO）。本此實驗選用平菇作為PPO的來源，用鄰苯二酚做底物來研究酪氨酸酶在不同pH值、溫度時的表現出的催化活性情況，以及加入乙酸、檸檬酸、L-半胱氨酸、NaCl等不同的抑制劑的抑制效果，以及平菇中酪氨酸酶對L-半胱氨酸的抑制類型，從而為平菇后期的處理和保存提供理論指導，具有積極的實踐指導價值。

1主要儀器與藥品

立式壓力滅菌鍋（LDZX-50KAS）； UV-1800紫外分光光度計（日本島津有限公司）；BS 224 S電子天平；（北京賽多利斯儀器系統有限公司）； UB-7酸度計（北京丹佛儀器有限公司）； DF-101B集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限公司）； QY-1000A移液器（北京青云卓立精密儀器有限公司）；氯化鈉（AR.國藥集團化學試劑有限公司）；L-半胱氨酸（AR.上海谷研生物科技有限公司）；鄰苯二酚；磷酸氫二鈉；磷酸二氫鈉；冰乙酸（AR.天津市天力化學試劑有限公司）；檸檬酸（AR.北京康普匯科技有限公司）。

2實驗方法

2.1栽培方法

首先制作培養基，然后裝袋，置于高壓蒸汽滅菌鍋中設置溫度為120℃、時間為120min。滅菌完成后，帶菌棒冷卻后將菌種均勻撒一薄層于培養基兩端，用白紙封口，置于培養房中定期澆水。

2.2 PPO粗酶液的提取

采用機械破碎法對蘑菇細胞進行粉碎，采用冰丙酮法對酪氨酸酶進行提取，蘑菇的質量與冰丙酮的體積之比為1：2。得到濾餅，用冰丙酮反復沖洗，直到無色。濾液加入等體積飽和（NH4）2SO4低溫放置，待沉淀完全后進行離心，0 ℃下， 10000 r·min-1離心 10min，收集沉淀物。得粗酶73.076g。

2.3粗酶液的純化

2.3.1 SePhadex G-100凝膠柱層析分離

首先從層析柱上端以一定速度通入磷酸緩沖液，當下端流出液在分光光度計280nm處檢測下吸光值小于0.05時，平衡完成。開始進樣。待層析柱平衡完成后，將進樣管接入樣品管中，上樣，其中應控制進樣速度與洗脫速度相當，進樣速度為6r/min。待樣品完全進入后，進樣管插入緩沖液中，進行洗脫，同時記錄儀器上的吸光值，每5min記一次，流出液達到5mL時，換管。繼續洗脫并收集流出液，直至吸光值接近0為止。

2.3.2純化酶的收集

取微量鄰苯二酚溶于少量水中，取6只試管，將鄰苯二酚溶液均分至這6只試管內，分別從對應序號的試管內吸取少量酶液，震蕩，放置10min，對比試管顏色變化。顏色較深，說明酶量較多，顏色較淺，表明，幾乎不含PPO。將含有PPO的流出液分別倒在50mL的燒杯中，再倒入10mL的冰丙酮提取，放置冰箱冷卻，有PPO的絮凝產生，2h后，對絮凝后的PPO進行離心，取沉淀物，再對沉淀物進行真空冷凍干燥。

2.3.3 PPO活力的測定

首先配制0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液（磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液）和濃度為0.01mol/L鄰苯二酚溶液，再將1.910mg的純化后的酪氨酸酶溶于5mL緩沖液（pH=7.0）中。取3mL緩沖液（pH=6.8）加入比色皿中，再用移液槍取0.1mL的鄰苯二酚溶液，再取0.1mL的PPO，搖勻，立即在402nm下，3min內每10s記錄一組吸光值A。實驗結束后作吸光值 A與反應時間t的關系曲線圖，由曲線最初直線段的斜率（ A/t）計算PPO活力。

2.3.4 pH對酶活力的測定

配制pH值為4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0的磷酸鹽緩沖液，在比色皿中分別加入3mL上面所配制的緩沖液，再用移液槍取0.1mL的鄰苯二酚溶液，再取0.1mL的PPO，搖勻，立即在402nm下，3min內每10s記錄一組吸光值A。由曲線最初直線段的斜率（ A/t）計算PPO活力。

2.3.5溫度對酶活力的測定

在比色皿中加入3mL的緩沖液（pH=6.8），用水浴鍋對鄰苯二酚溶液進行加熱，溫度梯度為15、20、25、30、35、40、45、50、55、60，在相應溫度下保溫3min。再用移液槍取0.1mL的鄰苯二酚溶液，換掉槍頭后，再取0.1mL的PPO，搖勻，立即在402nm下，3min內每10s記錄一組吸光值A。由曲線最初直線段的斜率（ A/t）計算PPO活力。

2.3.6抑制劑對酶活力的測定

用3mL，pH=6.8的緩沖溶液配制濃度如表 1所示的乙酸、檸檬酸、L-半胱氨酸、NaCl溶液，采用如上方法。3min內每10s記錄一組吸光值A。由曲線最初直線段的斜率（ A/t）計算PPO活力。計算PPO在不同濃度值下的相對酶活，并計算抑制率。

3結果與討論

3.1平菇的栽培

在后期的栽培過程中，有個別菌棒產生霉菌，致使該菌棒的生長受到影響，其他菌棒生長情況良好， 28天左右，整個菌棒長滿菌絲，菌棒呈現白色，變輕，之后3天，菌棒兩端開始長出幼小的子實體，隨后3天，平菇成熟，可以開始采摘。

3.2平菇中PPO的提取和純化

對沉淀物冷凍干燥后沉重，提取純酶1.910mg，純化收率為2.6%，純化率在正常范圍內。由于酶在生物體內的存在是微量的，平菇中PPO的活性在低溫下受到很好的抑制，因此冷凍過會進行研磨，能有效的控制平菇發生褐變，還抑制了PPO被分解。

3.3 PPO的活性抑制的動力學研究

3.3.1 pH對PPO酶活力的影響

不同pH對PPO酶活力的影響如所示，PPO的相對酶活受pH值的影響較為明顯，pH=6.8時達到最大酶活。在測定的pH值在4.0～8.0之間時，PPO的活性有一個先增強后減弱的過程，由此，在平菇的后期處理加工過程中，應盡量避免pH值接近6.8，而應該選擇一個pH值大于8.0的環境進行儲藏和加工。這樣能有效抑制PPO酶的活性。

3.3.2溫度對酶活力的影響

不同溫度對PPO酶活力影響如圖，PPO的相對酶活受溫度影響呈一個波動的狀態，但在局部范圍內影響較為明顯，在溫度左接近30℃時其相對酶活達到最高峰值。有圖可知，在15～60℃之間，PPO的活性先增強后減弱，當溫度在20℃以下或50℃以上時，活性較弱。主要原因是溫度較低時，酶促反應所需要的能量達不到，而溫度過高時，由于PPO是一種蛋白質，其過熱變形失活，也使反應無法正常進行。由此可見，在在平菇的后期處理加工過程中，可利用低溫抑制和相對高溫失活的方法延緩褐變現象的發生。

3.3.3抑制劑對酶活力的影響

不同抑制劑對平菇PPO活力影響也不同，通過實驗數據對比可知，L-半胱氨酸在低濃度時對平菇PPO的活性就表現出很強烈的抑制作用，在濃度為0.3mmol/L時就完全抑制了PPO的活性；乙酸對比其他兩種抑制劑而言，其抑制作用也較強烈，乙酸濃度為0.20%即可達到84.3%的抑制率；檸檬酸和氯化鈉同前兩種對比，抑制作用不明顯。

基金項目：大學生科技創新項目（項目編號：17cx15）；大學生創新創業訓練（項目編號：201710920029）。

參考文獻

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