山東省不同地區棉花內生真菌的多樣性和群落結構分析

宋海燕，李麗莉，盧增斌，于毅，張安盛，莊乾營，周仙紅，門興元

（山東省農業科學院植物保護研究所，濟南250100）

內生真菌指那些在生活史的某一段時間能夠與健康的宿主組織形成互利共生關系，而且至少在短時間內不會引起宿主組織發生病變的真菌[1]。內生菌能夠促進植物生長，提高植物抵御外界不良環境的能力，可增強植物對病害和蟲害侵襲的防御等[2]。自1898年Vogl從黑麥草 （Lolium temulentumL.）種子內分離出第1株內生真菌至今已有一百多年的歷史[3]。但是，之后很長時間內關于植物內生菌的研究寥寥無幾，近二十多年植物內生菌生態功能和經濟價值不斷被發現，植物內生菌已經成為國內外的研究熱點。內生真菌有著豐富的多樣性，依據已知的全球25萬種高等植物，每種植物4～5種宿主專化性內生真菌計算，內生真菌的種類或許超過100萬種[1]。據不完全統計，全世界已經作過內生真菌研究的植物只有幾百種，不僅涉及到具有重要經濟價值的高等植物，還包括低等的孢子植物如苔蘚、蕨類和地衣[4-6]。

關于內生真菌的種群與多樣性的研究多集中在野生植物，而對于人工干預過多的農田環境中的農作物（小麥、玉米、棉花等）的研究相對較少。關于棉花內生真菌的研究涉及群落結構、多樣性、對棉花病害的作用等方面[7-13]。美國Sword實驗室研究了得克薩斯州（Texas）不同地區的棉花內生真菌，發現了69個分類單元分布在41個屬中，分析了棉花內生真菌的多樣性與分布特征[14]。隨后，該實驗室對獲得的內生菌進行了功能篩選，明確了其增強棉花對棉鈴蟲、蚜蟲、病原線蟲的抗性作用，并大面積推廣應用了接種內生菌棉花，大大提高了棉花抗逆性和產量[15-18]。目前，國內尚無對棉花內生真菌展開系統性研究。

本文對山東省19個縣區的棉花內生真菌進行了系統采樣調查，通過形態學和分子技術鑒定了內生真菌種類，分析了棉花內生真菌的生物多樣性和群落結構，以期明確山東省的棉花內生真菌資源分布，探討生長環境與內生真菌群落結構和多樣性的關系，為深入研究內生真菌生態作用，篩選高效內生菌株，開發用于增加作物抗性和作物產量的工程菌等提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地點概況

山東屬暖溫帶季風氣候類型；年平均氣溫11～14℃，由東北沿海向西南內陸遞增，膠東半島、黃河三角洲在12℃以下，魯西南地區在14℃以上。年平均降水量一般在550～950 mm，由東南向西北遞減。本試驗于2017年6月、7月、8月在山東省19個主要產棉區采樣，各地區具體詳見表1。

1.2 試驗材料

在棉花蕾鈴期，每個采樣點選擇主栽棉花品種魯棉研22，采集新鮮健康的10株棉花樣本，將其立即放入密封袋中，貼上標簽，低溫保存帶回實驗室，在4℃下保存。

采用馬鈴薯葡萄糖 （Potato dextrose agar，PDA）培養基分離內生真菌。其中，新鮮馬鈴薯200 g，洗凈去皮后切成小塊，沸水煮30 min，用紗布過濾取濾液，加入瓊脂 3.5 g，葡萄糖 200 g，定容至2 000 mL。121℃滅菌30 min。待培養基冷卻至 45℃時，加入質量濃度為 100 mg·L－1的硫酸鏈霉素1 mL防止細菌污染。

表1 2017年采樣地情況介紹Table1 Introduction of sampling locations in 2017

1.3 主要試劑和儀器

SW-CJ-2FD潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；RXZ型智能人工氣候培養箱（寧波江南儀器廠）；LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；DYY-6D型電泳儀（北京六一儀器廠）；5424小型臺式高速冷凍離心機 （艾本德中國 （上海）有限公司）；SW-TFG-15型通風柜（杭州得聚儀器設備有限公司）；HHC型電熱恒溫水浴鍋 （上海博訊實業有限責任公司醫療設備廠）；749540-0000型微量電動組織勻漿器 （美國 KIMBLE公司）；Applied Biosystems 2720熱循環儀 （美國Applied Biosystems(ABI)公司）；GelDoc-itTS3凝膠成像分析系統 （美國 UVP公司）；引物 ITS1F、ITS4、真菌DNA提取試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1棉花葉片消毒。選取無病害癥狀、新鮮健康的棉花葉片用無菌水沖洗，去除表面的泥土和灰塵，用滅過菌的濾紙吸干葉片表面的水分，室溫晾干。用剪刀將葉片剪成邊長約2 cm的正方形小塊，每株選取2塊，依次用75%（體積分數）的乙醇浸泡30 s，2%（質量分數）次氯酸鈉溶液浸泡3 min，無菌水沖洗5次。最后，用滅菌的鑷子將葉片放置于滅菌濾紙上。

1.4.2內生菌的分離、保存。將刀片在酒精燈火焰上灼燒滅菌，待冷卻后，將滅菌后的葉片切成2個邊長約0.5 cm的正方形小塊，并做好標記，置于培養箱中培養3～4 d。記錄受內生真菌侵染的樣本數。

待平板上菌落長出，根據其形態特征判斷分離菌落種類，用取尖端菌絲的方法分離純化，經反復分離、純化，直至得到純化的菌落。

將純化的菌株分別轉移至斜面培養基上，菌株生長旺盛時，取出置于4℃下保存。

1.4.3內生真菌的內轉錄間隔區鑒定。內轉錄間隔 區 （Internal transcribed spacer，ITS）鑒定是 指對序列進行擴增、測序，通過將測序得到的序列與已知真菌序列比較，從而獲得未知真菌種屬信息的1種方法。本研究采用Ezup柱式真菌DNA提取試劑盒提取內生真菌總DNA，使用真菌 rDNA擴增的通用引物 ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）擴增內生真菌 rDNA-ITS序列[19]。ITS擴增的聚合酶鏈式反應 （Polymerase chain reaction，PCR）體系（25 μL）：ddH2O 17.25 μL，Bufferl 2.5 μL，dNTPs 2 μL， 引物 ITS11μL， 引物ITS41μL，HiFi酶 0.25μL，模板 DNA1μL。 PCR 反應條件：93℃預變性 3 min，93℃變性 45 s，57℃復性 45 s，72℃ 延伸 90 s，35個循環。擴增產物回收后，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將ITS序列的測序結果用美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）Blast軟件與 GenBank 數據庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 進 行 比對，獲得分子鑒定結果。

1.5 數據處理

采用定植率（Colonization rate，CR）評估棉花葉片中內生真菌定植頻率；采用相對分離率（Relative frequency，RF）比較判斷優勢菌屬；采用Shannon-Weaver指數（H）分析內生真菌的群落生物多樣性；用 Evenness（E）指數分析群落物種分布的均勻度；用Margalet指數（R）分析群落物種的豐富程度；用相似度系數（Sorenson’s similarity coefficient，CS）分析2個地區內生真菌種類組成的相似程度。計算公式為：CR＝（Ni/N）×100%，其中Ni指受內生真菌侵染的樣本數，N指總樣本數；RF＝（Ni/N）×100%，其中Ni為某種內生真菌的菌株數，N指總菌株數lnPi，其中k指某宿主中內生真菌的菌屬數，Pi指某種內生真菌的相對分離率；E＝H/lnS，其中H為 Shannon-Weaver指數，S為菌屬總數；R＝（S－1）/lnN，其中S為樣方內菌屬數，N為樣方內的總菌株數；CS＝2j/（a＋b），其中j指 2 個地區共有內生真菌屬數，a、b為2個地區各分離到的內生真菌的屬數。

以上數據均采用Microsoft Excel 2007計算。用Canoco生物統計軟件進行除趨勢對應分析（Detrended correspondence analysis，DCA）和內生真菌plot-species繪制，用EstimateS軟件分析并計算物種累積曲線，用Microsoft Excel 2007進行曲線繪制。采用SPSS 18.0軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同地區棉花內生真菌的定植率

從19個地區190株棉花的380個葉片塊中，共分離得到134個菌株，平均定植率為35.3%。由圖1可知，19個地區的棉花內生真菌定植率變化很大（5%～85%）。各地區定植率排序為：墾利（85%）＞茌平（70%）＞無棣（60%）＞金鄉 （55%）＞鄆城 （50%）＞高唐＝東昌府＝商河（45%）＞濟陽 （40%）＞濱城＝陽谷 （30%）＞魚臺＝桓臺（25%）＞夏津（20%）＞成武（15%）＞曹縣＝東阿（10%）＞惠民＝鄒城（5%）。

2.2 不同地區棉花內生真菌的群落結構

依據序列分析，共鑒定了134個菌株歸屬于15個屬，分別為鏈格孢屬Alternaria、鐮刀菌屬Fusarium、間座殼屬Diaporthe、青霉屬Penicillium、匍柄霉屬Stemphylium、離蠕孢屬Bipolaris、附球菌屬Epicoccum、彎孢屬Curvularia、黑孢子菌屬Nigrospora、葡萄座腔菌屬Botryosphaeria、橫梗霉屬Lichtheimia、Gibellulopsis、暗球腔菌屬Phaeosphaeria、分子孢子菌屬Cladosporium、毛球腔菌屬Setosphaeria（圖2）。其中，墾利鑒定出57個菌株， 歸屬于Alternaria、Fusarium、Diaporthe、Penicillium、Stemphylium5個屬；茌平鑒定了53個菌株，歸屬于Alternaria、Bipolaris、Epicoccum、Fusarium、Curvularia、Nigrospora6 個屬； 無棣鑒定出 43個菌株，歸屬于Alternaria、Diaporthe、Stemphylium、Botryosphaeria、Lichtheimia5 個屬。惠民和鄒城最少，只鑒定出1個菌株，歸屬于Alternaria屬。

圖1 棉花葉片內生真菌定植率Fig.1 Colonization rate of endophytic fungi from cotton

圖2 棉花葉片內生真菌的群落組成Fig.2 Composition of endophytic fungi isolated from cotton leaves

表2數據顯示，不同地區的優勢內生真菌各異，其中濱城和鄒城的優勢屬為Fusarium，相對分離率（RF）分別為 66.68%和 100.00%；曹縣的優勢屬為Alternaria和Gibellulopsis，2個菌屬RF均為50.00%，濟陽的優勢屬為Alternaria和Setosphaeria，2個菌屬RF均為 37.50%；其余地區優勢屬均為Alternaria。總體上，山東省的優勢屬為Alternaria，RF達到 77.12%。

2.3 不同地區棉花內生真菌的多樣性分析

19個地區的Shannon-Weaver指數大小排序為濟陽（1.26）＞茌平（1.15）＞濱城（0.87）＞曹縣（0.69）＞鄆城（0.64）＞無棣（0.59）＞墾利（0.57）＞金鄉 （0.51）＞商河 （0.35）＞成武＝東阿＝高唐＝惠民＝東昌府＝夏津＝陽谷＝魚臺＝鄒城＝桓臺（0.00）。濟陽的Shannon-Weaver指數最大，其內生真菌群落生物多樣性最高。曹縣的均勻度指數最大 （1.00），濟陽的豐富度指數最大（1.45）（表3）。

表2 棉花葉片內生真菌的相對分離率（RF）Table2 Relative frequency (RF) of endophytic fungi from cotton %

表3 棉花內生真菌多樣性分析Table3 Diversity indices of endophytic fungi from cotton

2.4 不同地區棉花內生真菌的相似度分析

在圖3中，DCA1代表各地區內生真菌多樣性和菌株總數量復合梯度，DCA2代表各菌屬類別和菌株數量的復合梯度。其中成武、東阿、高唐、惠民、東昌府、夏津、陽谷、魚臺、鄒城的位置重合，相似度最高；鏈格孢屬Alternaria與這9個地區的距離最短，說明其生態關系較近，即Alternaria為這些地區棉花內生真菌的優勢屬。鄆城與金鄉、墾利、商河的距離較近，其棉花內生真菌群落相似度系數均為0.8；濟陽與桓臺距離較遠，相似度系數為0；濱城僅發現鐮刀菌屬Fusarium，與曹縣、成武、東阿、高唐、惠民、濟陽、東昌府、夏津、陽谷、魚臺、鄒城的相似度系數為0（表4）。

圖3 不同地區內生真菌群落的DCA排序Fig.3 DCA ordination diagram of endophytic fungi in different areas

2.5 不同地區棉花內生真菌的物種累積曲線

由各地棉花內生真菌物種累積曲線（圖4）可以看出，高唐需要5個以上樣本，東昌府、陽谷、桓臺需要10個以上樣本，金鄉、成武、夏津、魚臺需要15個以上樣本，其他地區需要20個以上的樣本，才能獲得罕見的菌屬。山東省（19個地區合計）需要400個以上樣本（圖5），才能獲得罕見的菌屬。

表4 不同地區棉花內生真菌群落結構的相似度系數（CS）Table4 Sorenson’s similarity coefficients (CS) of endophytic fungi of different areas from cotton

圖4 山東省不同地區棉花內生真菌的物種累積曲線Fig.4 Accumulation curves of endophytic fungi from cotton leaves in different areas of Shandong province

2.6 不同地區內生真菌的聚類分析

對各地區內生真菌的群落組成進行聚類分析，在類間距離為10時，分為兩大類，第1類包括惠民、鄒城、曹縣、東阿、陽谷、魚臺、成武、夏津、濟陽、濱城區、桓臺、高唐、東昌府區、商河、鄆城、金鄉，此類內生真菌定植率低，菌屬數目少；第2類包括茌平、無棣、墾利，此類內生真菌定植率高，菌屬數目多（圖6）。

圖5 山東省棉花內生真菌的物種累積曲線Fig.5 Accumulation curves of endophytic fungi from cotton leaves in Shandong province

3 討論與結論

通過對山東省主要棉花種植區的系統取樣調查，表明內生真菌在棉花中普遍存在。山東省棉花內生真菌的平均定植率為35.3%，這是因為取樣少造成的，在以后的研究中還須增加取樣量，以獲得更多的內生真菌。不同地區定植率差異很大，其中墾利的棉花內生菌定植率達到85%，其次為茌平、無棣；而惠民、鄒城的定植率僅為5%。這可能與當地的氣候、地理因素有關。造成這種差異的原因，還應進一步研究，可能對指導內生菌應用有重要意義。

圖6 不同地區內生真菌的聚類分析Fig.6 Cluster analysis of endophytic fungi in different areas

本研究共分離得到134個菌株歸屬于15個屬， 分別為Alternaria、Fusarium、Diaporthe、Penicillium、Stemphylium、Bipolaris、Epicoccum、Curvularia、Nigrospora、Botryosphaeria、Lichtheimia、Gibellulopsis、Phaeosphaeria、Cladosporium、Setosphaeria。其中，Alternaria、Fusarium、Epicoccum、Cladosporium屬的一些內生真菌被證明是植物病原菌的拮抗菌或對害蟲、線蟲有抗生作用[20-23]。

山東省的棉花葉片內生真菌優勢屬為Alternaria，這與之前報道的Alternaria是暖溫帶植物常見優勢屬的結論[24-25]一致。在很多植物的不同部位都曾發現Alternaria，例如在廣藿香根部[19]、茅蒼術葉片[26]、紫莖澤蘭葉片[27]、西洋參莖部[28]。Alternaria屬也是美國得克薩斯州棉區的主要棉花內生菌[12]。筆者調查的山東省19個地區中，Alternaria屬在17個地區出現，表明Alternaria屬具有較強的環境適應能力，與棉花形成了較好的協同進化關系。

與Alternaria屬的廣泛分布不同，一些內生真菌分布具有明顯的區域性，例如：Bipolaris、Curvularia、Epicoccum屬僅出現在茌平；Cladosporium、Phaeosphaeria、Setosphaeria屬僅出現在濟陽；Gibellulopsis屬僅出現在曹縣；Lichtheimia屬僅出現在無棣；Penicillium屬僅出現在墾利。

本研究采用Shannon-Weaver指數分析各地區內生真菌群落多樣性。影響Shannon-Weaver指數大小的因素有2個：其一是種類數目，即豐富度；其二是種類中個體分配上的均勻性。種類數目越多，多樣性越大；同樣，種類之間個體分配的均勻性增加也會使多樣性提高[29]。濟陽的均勻度指數（0.91）和豐富度指數（1.45）均較高，故Shannon-Weaver指數最高（1.26），說明所研究區域中濟陽的棉花內生真菌的生物多樣性最豐富。而有的地區，棉花內生真菌的生物多樣性很低，例如成武、東阿、高唐、惠民、東昌府、夏津、陽谷、魚臺、鄒城、桓臺等地Shannon-Weaver指數為0，只鑒定出1個屬的內生真菌。相似度系數是反映2個不同生境中內生真菌菌群組成相似程度的重要參數。相似度系數越大，2個生境的多樣性水平越接近。本文用聚類分析的方法，將取樣的19個地區分為兩大類，第1類包括惠民、鄒城、曹縣、東阿、陽谷、魚臺、成武、夏津、濟陽、濱城、桓臺、高唐、東昌府、商河、鄆城、金鄉，此類內生真菌定植率低，鑒定出的菌屬數目少；第2類包括茌平、無棣、墾利，此類內生真菌定植率高，鑒定出的菌屬數目多，且優勢屬相對分離率高，均為鏈格孢屬Alternaria。該結果顯示山東省棉花內生真菌多樣性存在地區性差異。

植株內生菌的來源主要有2條途徑：一是來自根際土壤微生物，經根系運輸到植株體內；一是來自大氣中微生物，經氣孔進入植株體內[30]。很多因素都可以影響內生真菌的組成結構，如溫度、濕度、季節、地理位置、海拔高度、組織成熟度、組織結構和相關植被等[31-34]。本研究發現，地域對棉花內生真菌具有一定的影響，土壤濕度大的地區內生真菌定植率高、種類多。但決定植物內生真菌菌群分布、組成和演替變化的因素和作用機制是多方面的、較為復雜的，需要對棉花內生真菌進一步深入研究。