熱量限制治療海綿體神經損傷大鼠勃起功能障礙

盛明雄 萬玲玲 劉昌明 李惠長 張家彬

福建醫科大學附屬閩東醫院泌尿外科（福建福安 355000）

熱量限制（caloric restriction）是指在保證生物體不發生營養不良的情況下，限制每日攝取的總熱量；是延長生物壽命的最可靠方法［1］，而且有抗腫瘤［2］和神經保護［3］等多種作用。近年來熱量限制治療勃起功能障礙越來越引起關注，但其機制尚不明確。研究表明［4-5］熱量限制通過上調轉硫作用引起內源性硫化氫增多是其多種有益作用的主要機制。硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是第3種被發現的具有內源性活性的氣體信號分子［6］，在體內具有重要的生理調節功能，包括促進陰莖勃起［7］和神經保護［8］等。本研究通過建立大鼠海綿體神經損傷模型，分為假手術組、損傷對照組、H2S組和熱量限制組，觀察比較各組的血清H2S水平、勃起功能和海綿體神經修復情況，旨在證實熱量限制能引起大鼠內源性H2S升高，促進損傷的海綿體血管神經修復，從而治療海綿體神經損傷大鼠的勃起障礙。

1 材料與方法

1.1 主要材料 硫化氫鈉（sodium hydrosulfide，NaHS）（上海遠慕生物科技有限公司），H2S檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），甲苯胺藍（SIG?MA，批號：MKBF7921）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 將112只SD大鼠（購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，體質量為200～240 g，3個月齡，性交配實驗證實有正常性功能）隨機分為4組，每組28只：假手術組僅游離海綿體神經3 mm并避免損傷；損傷對照組僅建立海綿體神經鉗夾損傷動物模型；H2S組造模前1 h予NaHS（20 pmol/kg）腹腔注射，其他各組腹腔注射同量的生理鹽水；熱量限制組造模后按實驗方案給予熱量限制。

1.2.2 海綿體神經鉗夾損傷動物模型的建立 大鼠用1%的戊巴比妥50 mg/kg經腹腔注射麻醉。備皮消毒后，取下腹部正中切口約2 cm逐層打開至盆腔，延長切口至陰莖根部，顯微鏡下在前列腺后外側找到并仔細游離雙側海綿體神經（cavernous nerve，CN）3 mm，并用顯微血管鉗鉗夾CN 2 min，血管鉗扣合至最后一個咬齒，術中避免將海綿體神經完全離斷導致造模失敗。術中注意無菌操作，術后予青霉素3萬U腹腔注射以預防大鼠感染死亡。

1.2.3 熱量限制方案 除熱量限制組外的大鼠給予基礎飼料，自由攝食；熱量限制組給予基礎飼料并單籠喂養，第1周喂食量其他組平均攝食量的80%，第2周喂食量為其他組平均攝食量的70%，第3周后喂食量維持在其他組平均攝食量的60%直至處死。

1.2.4 血清硫化氫水平測定 分別于術后1、2、4、12周每組各隨機取7只大鼠，經心臟采血提取血清測定大鼠血清硫化氫水平，采血后采用頸椎脫臼法處死。首先在離心管中加入0.25 mL血清、0.45 mL水和0.25 mL 1%醋酸鋅后室溫震蕩混勻；再加入0.25 mL10%三氯乙酸，14 000 r/min離心10 min；收集上清加入133 μL 20 mmol/L對氨基二甲苯胺鹽酸鹽，133 μL 30 mmol/L三氯化鐵，充分混勻，室溫孵育20 min。用酶標儀在波長665 nm檢測吸光度，根據標準曲線計算血清H2S濃度。

1.2.5 陰莖勃起功能測定 術后12周各組7只大鼠均通過電刺激CN促使海綿體充血勃起，然后進行陰莖海綿體內壓（intracavernous pressure，ICP）及平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）測定。

1.2.6 海綿體神經甲苯胺藍染色 術后1、2、4、12周取鉗夾處遠端3 mm的海綿體神經甲苯胺藍染色，在顯微鏡下觀察CN整個橫切面軸突的數目。

1.2.7 免疫組化法檢測大鼠陰莖組織中一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的表達 冰凍切片拿出后晾干，PBS洗3×3 min；3%H2O237℃孵育10 min，PBS沖洗3×3 min；置0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中熱修復，90℃修復15 min后自然冷卻至室溫，PBS沖洗3×3 min；滴加一抗4℃冰箱孵育過夜（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照），轉至室溫平衡30 min，PBS沖洗3×5 min；滴加二抗，37℃孵育15 min，PBS沖洗3×5 min；DAB反應染色，自來水充分沖洗；蘇木素復染，脫水透明后封片。顯微鏡下觀察，每張免切片隨機選擇3個不同的視野（×200）觀察，進行染色強度計分與陽性細胞百分比評分，最終評分為兩者加和。染色強度計分：無明顯著色為0分，輕微為1分，中度為2分，重度為3分。陽性細胞百分比評分：0～5%分評為0分，6%～25%評1分，26%～50%評2分，51%～75%評3分，＞75%均評為4分。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件分析。計量資料采用ANONA單因素方差分析或t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況 所有大鼠飼養順利，成功建立海綿體神經鉗夾損傷動物模型，術后恢復順利，無死亡。

2.2 各組大鼠血清H2S含量比較 術后1、2、4、12周，血清H2S熱量限制組和H2S組高于假手術組，而損傷對照組低于假手術組，熱量限制組和H2S組之間差異無統計學意義；假手術組術后各個時間點較為穩定，損傷對照組逐漸減少，熱量限制組和H2S組逐漸增多。見表1。

2.3 陰莖勃起功能測定 配對t檢驗顯示，損傷對照組大鼠在電刺激海綿體神經時均無明顯陰莖勃起反應，而假手術組、熱量限制組和H2S組大鼠在電刺激時有明顯陰莖勃起反應。ANONA分析顯示電刺激前ICP/MAP比值差異無統計學意義，電刺激后各組差異有統計學意義；兩兩比較LSD檢驗顯示，熱量限制（P=0.000）和H2S組（P=0.000）低于假手術組，高于損傷對照組；而熱量限制組和H2S組之間差異無統計學意義（P=0.051）。見表2。

表1 各組血清H2S含量比較（n=7）Tab.1 The comparison of serumal H2S between each group x± s，μmol/L

2.4 海綿體神經甲苯胺藍染色軸突數 術后1、2、4、12周，假手術組軸突數多于其他組，熱量限制組和H2S組多于損傷對照組，熱量限制組和H2S組之間差異無統計學意義；假手術組術后各個時間點較為穩定，損傷對照組逐漸減少，熱量限制組和H2S組逐漸增多。見表3、圖1。

表2 術后12周各組ICP/MAP比值（n=7）Tab.2 The ratio of ICP/MAP 12 weeks postoperatively x±s

表3 術后各組海綿體神經軸突計數比較（n=7）Tab.3 The comparison of cavernous myelinated axons between each group postoperatively ±s，條

表3 術后各組海綿體神經軸突計數比較（n=7）Tab.3 The comparison of cavernous myelinated axons between each group postoperatively ±s，條

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與損傷對照組比較，bP＜0.05；與熱量限制組比較，cP＜0.05

組別假手術組損傷對照組熱量限制組H2S組F值P值1周85.6±1.27 56.4±1.13a 59.0±1.15ab 58.4±0.98ab 1 035.303 0.000 2周82.3±2.22 51.6±1.99a 62.4±1.72ab 61.4±0.98ab 369.740 0.000 4周84.0±2.45 37.4±2.07a 68.1±0.69ab 69.9±1.35ab 857.182 0.000 12周84.4±3.64 28.1±1.77a 78.4±0.98ab 78.7±1.50ab 989.864 0.000

圖1 海綿體神經甲苯胺藍染色（×200）Fig.1 The expression of cavernous myelinated axons by toluidine blue stain（× 200）

2.5 免疫組化法檢測大鼠陰莖組織中NOS表達術后1、2、4、12周，假手術組NOS表達均多于其他組，熱量限制組和H2S組多于損傷對照組，熱量限制組和H2S組之間差異無統計學意義；假手術組術后各個時間點較為穩定，損傷對照組逐漸減少，熱量限制組和H2S組逐漸增多。見表4、圖2。

3 討論

熱量限制是一種有計劃地減少由食物提供熱量的進食方式，是指在保證生物體不發生營養不良的情況下，將其正常進食所得熱量減少30%～50%。熱量限制對機體有多種有益作用；目前熱量限制對勃起障礙的治療作用越來越引起關注。LA等［9］發現，低熱量和低脂飲食有助提高陰莖勃起功能和體內睪酮水平，但其機制尚需不明確。本研究首次發現熱量限制引起內源性H2S增多是其主要機制之一。

表4 各組大鼠陰莖組織NOS表達比較（n=7）Tab.4 The comparison the expression of NOS in cavernous body between each group ±s，分

表4 各組大鼠陰莖組織NOS表達比較（n=7）Tab.4 The comparison the expression of NOS in cavernous body between each group ±s，分

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與損傷對照組比較，bP＜0.05；與熱量限制組比較，cP＜0.05

組別假手術組損傷對照組熱量限制組H2S組F值P值1周7.14±0.69 4.71±0.76a 5.85±0.69ab 6.00±0.58ab 14.872 0.000 2周7.28±0.49 3.57±0.53a 6.00±0.57ab 6.28±0.49ab 63.478 0.000 4周7.42±0.53 2.71±0.76a 6.29±0.49ab 6.43±0.48ab 58.233 0.000 12周7.57±0.53 2.29±0.95a 6.57±0.53ab 6.71±0.76ab 77.116 0.000

圖2 免疫組化法檢測大鼠陰莖組織中NOS表達（×400）Fig.2 The expression of NOS in cavernous body by immunohistochemical method（× 400）

研究表明［4］熱量限制可通過上調轉硫作用引起內源性H2S增多。在哺乳動物體內，H2S由含硫氨基酸在—胱硫醚-β-合酶和胱硫醚-γ-裂合酶轉硫作用下產生；是一種內源性氣體信號分子，具有神經保護等多種作用。SARUKHANI等［10］發現H2S能抗6-羥基多巴誘導的神經毒性，具有明顯的抗帕金森和神經保護作用。H2S還可作用于ATP敏感性鉀離子通道舒張血管平滑肌，與睪酮及NO協同作用舒張陰莖海綿體平滑肌，從而促進陰莖勃起［7］。本研究顯示：熱量限制可以引起內源性H2S水平增多，給予外源性H2S也有相似作用；熱量限制組和H2S組的海綿體神經軸突數多于損傷對照組且逐漸增多，而損傷對照組逐漸減少。本研究率先證實熱量限制既可引起H2S水平增多又可促進損傷的海綿體神經修復，這表明熱量限制可通過促進內源性H2S水平增多，從而促進海綿體神經損傷修復；這可能是其對治療海綿體神經損傷大鼠勃起功能障礙的主要機制之一。研究表明［4-5，11］熱量限制引起內源性硫化氫增多是其多種有益作用的主要機制；本研究結果與其相符。

陰莖海綿體組織中NOS主要由神經型NOS產生［12］，是催化L-精氨酸分解產生在陰莖勃起過程中起決定作用的遞質NO的關鍵酶，其活性高低可反映陰莖的勃起功能，勃起功能障礙與陰莖組織NOS活性的下降有關［13］。目前關于海綿體神經再生的研究也常常通過檢測陰莖背神經中NOS陽性神經纖維表達來間接反映海綿體神經纖維的再生情況［14］。本研究發現損傷對照組NOS表達較假手術組明顯降低，而熱量限制和外源性H2S均可促進陰莖海綿體NOS表達。這表明，熱量限制和外源性H2S均可促進遞質NOS產生，并促進海綿體神經再生，從而改善勃起功能。

前列腺氬氦刀冷凍消融術由于療效確切，創傷小；成為前列腺癌的可選擇治療方法之一［15-16］。勃起功能障礙是其術后最常見的并發癥，術中冷凍冰球損傷支配陰莖勃起的血管神經束是術后發生勃起功能障礙的主要原因［17］。目前多采用術后早期口服5型磷酸二酯酶抑制劑治療，但因無法修復損傷的血管神經束，療效欠佳。本研究發現熱量限制可促進海綿體神經再生，從而改善勃起功能；這為前列腺癌氬氦刀冷凍消融術后勃起功能障礙提供新思路。

本研究存在不足之處，雖然本研究證實熱量限制可促進海綿體神經損傷大鼠勃起障礙康復，但是由于本研究觀察時限最長只到12周，其長期療效尚需進一步研究。

綜上所述，熱量限制通過引起內源性H2S水平升高促進大鼠海綿體損傷神經修復和陰莖海綿體NOS表達，從而促進海綿體神經損傷大鼠勃起障礙康復。