離子液體—超聲輔助—固相萃取法提取富集急性子藥材中的4種鳳仙萜四醇皂苷

吳謙 林花 劉迎 金永日 黎鵬 劉偉杰 李緒文

摘 要 建立了一種綠色、快速、高效萃取和富集中藥急性子中4種鳳仙萜四醇皂苷的方法。采用離子液體并結(jié)合超聲輔助萃取急性子中的化學(xué)成分，利用固相萃取小柱富集提取液中的鳳仙萜四醇皂苷。通過考察離子液體種類及用量、pH值、超聲時(shí)間、固相萃取劑和洗脫劑等實(shí)驗(yàn)條件對提取率的影響，確立了最優(yōu)萃取劑為[C6mim]Br，最優(yōu)萃取條件： 萃取劑用量為0.9 mL，提取液pH=7.0，超聲為30 min，最優(yōu)富集條件： 固相萃取小柱填料為0.9 g CHP20/P120，上樣流速為1.5 mL/min，洗脫劑為1.5 mL甲醇。在最優(yōu)條件下，4種鳳仙萜四醇苷加標(biāo)回收率在92.1%～108.2%之間，相關(guān)系數(shù)范圍為0.9945～0.9975，檢出限范圍為1.8～4.5 μg/mL， RSD<3.9%。本方法與傳統(tǒng)回流提取方法提取效果接近，可準(zhǔn)確測定急性子中4種鳳仙萜四醇苷含量。

關(guān)鍵詞 離子液體； 固相萃取； 急性子； 鳳仙萜四醇皂苷； 超聲輔助

1 引 言

急性子為鳳仙花屬植物鳳仙花Impatiens balsamina L.的干燥成熟種子。在臨床上可用于避孕[1]、終止早孕及治療梗阻[2]、癌癥及骨質(zhì)增生[3]。研究表明，急性子中主要活性成分包括皂苷[4]、黃酮[5]、萘醌[6]、揮發(fā)油[7]和多糖[8]等。其中，2015版《中國藥典》以鳳仙萜四醇苷A與鳳仙萜四醇苷K的含量之和大于0.2%作為急性子藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[9]。

鳳仙萜四醇皂苷屬于Baccharane型皂苷，具有抗腫瘤及抗風(fēng)濕作用[10，11]。由于鳳仙萜四醇皂苷無紫外吸收，因此現(xiàn)有的皂苷含量測定以高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器（HPLC-ELSD）法為主要測量手段。譚麗娜等[12]利用HPLC-ELSD法測定了急性子中鳳仙萜四醇苷A和鳳仙萜四醇苷K的含量，Li等[13]通過HPLC-ESI-MSD 及 HPLC-ELSD法測定了急性子中8種鳳仙萜四醇苷。而這些含量測定中所使用的提取方法均為回流法。盡管該方法提取過程操作較為簡單，但存在著提取周期長、有機(jī)試劑用量大、皂苷提取與富集率低等缺點(diǎn)。因此，亟待研發(fā)一種快速、高效、綠色的鳳仙萜四醇皂苷提取方法。

離子液體是指在室溫下完全由離子組成的有機(jī)液體物質(zhì)。由于其呈液態(tài)的溫度范圍寬，對有機(jī)物具有較好的溶解性能，在天然產(chǎn)物提取中有著廣泛應(yīng)用。文獻(xiàn)已報(bào)道過利用離子液體萃取萜類[14]、黃酮類[15]、生物堿類[16]、類脂類[17]等天然產(chǎn)物中的有效成分。近年來，于秀培等[18]建立了分散液-液微萃取測定藿香正氣口服液中厚樸酚及和厚樸酚含量的方法，Xu等[19]建立了離子液體-超聲輔助-分散固相微萃取測定了天然色素類化合物的方法。此類離子液體與固相萃取、液-液萃取[20]、液相微萃取[21]、離子液體/超臨界萃取[22]等多種富集手段的聯(lián)用，進(jìn)一步拓展其在天然產(chǎn)物成分含量分析中的應(yīng)用[23]。與傳統(tǒng)的提取方法相比，離子液體聯(lián)用技術(shù)不僅能夠有效富集天然產(chǎn)物中活性成分，更簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，減少了有機(jī)試劑使用量及環(huán)境污染。

采用離子液體超聲輔助提取及固相萃取聯(lián)用作為提取方法，結(jié)合HPLC-ELSD法測定了急性子藥材中4種主要的鳳仙萜四醇苷A、B、K、M的含量，通過考察影響提取率的主要因素，確立了最佳提取條件。本方法具有簡單、分析速度快的優(yōu)點(diǎn)，為急性子乃至其它中藥材中活性成分的分析提供了新思路。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 離子液體-超聲輔助-固相萃取法 準(zhǔn)確稱取急性子干燥藥材粉末（過60目篩）0.1 g，加入2.5 mL水和0.9 mL [C6min]Br，渦旋振蕩提取30 s，放入超聲清洗器中，在250 W功率下超聲30 min，提取液以1.5 mL/min流速吸附于填有0.9 g CHP20/P120大孔樹脂固相萃取小柱，用1.5 mL甲醇洗脫，減壓蒸餾回收提取液，并以甲醇準(zhǔn)確定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，吸取20 μL續(xù)濾液注入高效液相色譜測定，平行測定3次。

2.2.2 回流提取法 準(zhǔn)確稱取急性子干燥藥材粉末（過60目篩）0.1 g， 80%乙醇溶液回流提取2次，減壓蒸餾回收洗脫液并以甲醇準(zhǔn)確定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，吸取20 μL續(xù)濾液注入高效液相色譜測定，平行測定3次。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別準(zhǔn)確稱取鳳仙萜四醇苷A、B、K、M 各1.0 mg，用2.5 mL水溶解，加入0.9 mL [C6mim]Br離子液體，渦旋30 s，超聲30 min后，以1.5 mL/min上樣流速經(jīng)0.9 g CHP20/P120型大孔樹脂SPE柱吸附。以1.5 mL甲醇洗脫，減壓蒸餾回收洗脫液，并以甲醇準(zhǔn)確定容至1 mL，再逐級稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.4 色譜條件 色譜柱： Tnature C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm，華譜新創(chuàng)科技有限公司）； 流動相： 甲醇（A）-水（B）。梯度洗脫條件： 0～16 min， 50% A；16～20 min， 45% A， 20～23 min， 50% A； 23～27 min， 55% A； 27～35 min， 60% A； 35～40 min， 55% A； 40～50 min， 70% A； 50～60 min， 80% A； 60～70 min， 90% A。柱溫： 30℃； 流速： 1.0 mL/min； 進(jìn)樣體積： 20.0 μL。

2.2.5 ELSD檢測條件 載氣： 空氣； 載氣壓力： 2.6 bar； 漂移管溫度： 102℃。

3.4 急性子藥材中4種鳳仙萜四醇苷含量的測定

分別利用本研究建立的提取方法與乙醇回流提取方法制備了樣品溶液，并測定了4份市售急性子中4種鳳仙萜四醇苷的含量，標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品溶液色譜圖見圖6，實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表3。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)方法與乙醇回流提取的含量測定的結(jié)果差異較小，說明本方法與傳統(tǒng)提取方法的提取效果相差較小，可準(zhǔn)確測定急性子中4種鳳仙萜四醇皂苷的含量。

4 結(jié) 論

建立了一種超聲輔助-離子液體-固相萃取法萃取并富集急性子藥材中鳳仙萜四醇苷類成分的新方法。本樣品前處理方法減小了萃取劑用量，并具有較好回收率。本方法具有快速、高效、環(huán)保、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，為急性子藥材質(zhì)量控制提供了新的樣品前處理方法，也為中藥材及其制劑中功效成分的提取與富集新方法的探究提供了有價(jià)值的參考。

References

1 WANG Yu-Sheng. Chinese Pharmacological and Application. Beijing： People's Health Publishing House， 1983： 799

王浴生. 中藥藥理與應(yīng)用. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 1983： 799

2 ZHAO Liang-Qian. Jiangsu J. Tradit. Chin. Med.， 2002， 23（9）： 25

趙良倩. 江蘇中醫(yī)藥， 2002， 23（9）： 25

3 MA You-Yun. Shanghai J. Tradit. Chin. Med.， 2007， 41（1）： 78

馬有運(yùn). 上海中醫(yī)藥雜志， 2007， 41（1）： 78

4 Fu Y， Gao W， Yu J J， Chen J， Li H J， Li P. J. Pharmaceut. Biomed.， 2012 ， 64-65（4）： 64-71

5 WANG Wei， JU Cheng-Guo， ZHU Xu， ZHAO Huan-Jun. Chin. Tradit. Pat. Med. ， 2011， 33（2）： 199-202

王 巍， 鞠成國， 朱 旭， 趙煥君. 中成藥， 2011， 33（2）： 199-202

6 Wang Y C， Lin Y H. Fitoterapia. 2012， 83（8）： 1336-1344

7 CHEN Ming-Xia， WANG Xiang-Li， ZHANG Yu-Jie. Chin. J. Chin. Mater. Med.， 2006， 31（11）： 928-929

陳明霞， 王相立， 張玉杰. 中國中藥雜志， 2006， 31（11）： 928-929

8 TONG Miao-Miao， ZHAI Yan-Jun， WANG Tian-Min， LI Na. Chin. Tradit. Pat. Med. 2011， 33（7）： 1171-1174

佟苗苗， 翟延君， 王添敏， 李 娜. 中成藥， 2011， 33（7）： 1171-1174

9 Chinese Pharmacopoeia Commission， Chinese Pharmacopoeia， vol. I， Beijing ： The Medicine Science and Technology， 2015： 263

中華人民共和國藥典（一部）. 國家藥典委員會. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2015： 263

10 Wu Q， Jin Y R， Yao H， Liu Y， Li P， Li X W. Chem. Res. Chinese U.， 2017， （5）： 1-5

11 LI Hui-Jun， YU Jun-Jie， LI Ping. China Patent， 201010126336.4， 2012

李會軍， 于俊杰， 李 萍. 中國專利， 201010126336.4， 2012

12 TAN Li-Na， LU Juan， ZHU Na， MENG Lei， ZHU Hong-Wei， LIU Yu-Wei， JIN Yong-Ri， LI Xu-Wen. Chin. J. Pharm. Anal.， 2009， 29（5）： 717-720

譚麗娜， 陸 娟， 朱 娜， 孟 磊， 朱紅微， 劉玉瑋， 金永日， 李緒文. 藥物分析雜志， 2009， 29（5）： 717-720

13 Li H J， Yu J J， Li P. J. Pharmaceut. Biomed.， 2011， 54（4）： 674-680

14 Sara L， Héctor R， Alberto A， Ana S. Fluid Phase Equilibr.， 2014， 361（2）： 37-44

15 Xu W， Chu K D， Li H， Zhang Y Q， Zheng H Y， Chen R L， Chen L D. Molecules， 2012， 17（12）： 14323-14335

16 Ana F MCláudio， Ana M F， Mara G F， Joo A P C. Green Chem.， 2013， 15（7）： 2002-2010

17 Choi S A， Lee J S， Oh Y K， Jeong M J， Kim S W， Park J Y. Algal Res.， 2014， 3（1）： 44-48

18 YU Xiu-Pei， FENG Fang， TENG Bao-Qi， CHEN Yu-Yu. Pharm. Clin. Res.， 2012， 20（3）： 264-266

于秀培， 馮 芳， 滕寶褀， 陳玉宇. 藥學(xué)與臨床研究， 2012， 20（3）： 264-266

19 Xu J J， Li Q， Cao J， Warner E， An M R， Tan Z J， Wang S L， Peng L Q， Liu X G. J. Chromatogr. A， 2016， 1463（9）： 32-41

20 Yan H Y， Sun N， Han Y H， Yang C， Wang M Y， Wu R J. J. Chromatogr. A， 2013， 1307（17）： 21-26

21 Visser A E， Swatloski R P， Reichert W M， Griffin S T， Rogers R D. Ind. Eng. Chem. Res.， 2000， 39（10）： 3596-3604

22 Wang X Z， Li X W， Li L J， Li M， Wu Q， Liu Y， Yang J， Jin Y R. Anal. Methods， 2016， 8（35）： 6566-6572

23 Yang C， Sun Y Y， Kyung H R， Yan H Y. J. Chromatogr. A， 2014， 1361（26）： 53

24 CHEN Yi-Xin， FENG Qing-Sheng， WANG Xiao-Zhong， LI Lan-Jie， LI Xu-Wen， JIN Yong-Ri. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（7）： 1106-1111

陳一鑫， 馮清勝， 王曉中， 李蘭杰， 李緒文， 金永日. 分析化學(xué)， 2016， 44（7）： 1106-1111

25 Li H J， Liu Y， Yi Y T， Miao Q， Liu S J， Zhao F， Cong W， Wang C H， Xia C H. J. Chromatogr. B， 2017， 1048： 56-63

Abstract A green， rapid and efficient method was developed for the extraction of 4 kinds of hosenkosides from the seeds of Impatiens balsamina L. The hosenkosides were extracted by ionic liquid， and then enriched by solid phase extraction. The effects of the kinds and volume of ionic liquid， pH value， ultrasonic time， solid phase extractant and eluent on the extraction fields were investigated and optimized. Under the optimum conditions， the recoveries of 4 kinds of hosenkosides were between 92.1% and 108.2%， the correlation coefficients were 0.9945-0.9975， and the detection limits were 1.8-4.5 μg/mL. The RSD values were all less than 3.9%. The experimental results showed that this method was fast， efficient， environmental protection. This study provided a reference for the extraction and enrichment of trace components in Chinese medicinal herbs.

Keywords Ionic liquid； Solid phase extraction； Seeds of Impatiens balsamina L； Hosenkosides； Ultrasonic-assisted

（Received 26 January 2018； accepted 7 March 2018）