固定化技術提高微生物對土壤中石油烴降解性能研究進展

王曉玲，陳宏坤，鄭 瑾，韓占濤，高春陽

(1.中國地質科學院水文地質與環境地質研究所，河北石家莊 050061;2.石油石化污染物控制與處理國家重點實驗室,中國石油集團安全環保技術研究院，北京 102206；3.河北省、中國地質調查局地下水污染機理與修復重點實驗室，河北石家莊 050061)

在過去的幾十年里，石油一直是人類最主要的燃料來源之一,也是石油化工的基礎[1-2]。石油在開采、冶煉、運輸和使用過程中往往發生泄漏，造成大量水土環境的污染[3]。石油烴包括飽和烴、芳香烴、膠質、瀝青質4種主要組分，其中多環芳烴等有致癌、致畸、致突變特性[2,4]，因此，石油污染一直是國際環境修復界的重要修復目標。當前我國的石油污染已經顯現，水土環境石油污染的修復工作正在興起。高效、低成本、不產生次生污染的修復技術仍是石油污染修復領域的重要研發方向[5]。石油污染土壤的修復方法包括焚燒、熱脫附、化學淋洗、化學氧化、電動修復、生物添加、生物催化、生物堆等[6]。其中生物修復方法由于其經濟可行性和環境友好性成為最受歡迎的修復方式[7]。但在自然環境中，由于土著微生物的競爭，土壤酸堿度、溫度以及石油烴的毒性效應使得外源高效降解菌難以發揮其作用[8]。

固定化菌是將降解菌以某種方式固定在一種材料上，所形成的固定化菌比游離菌適應環境能力更強[9]，可以抵抗環境毒性，實現多細胞協同作用。多種石油烴高效降解菌，如寡養食單胞菌、芽孢桿菌、假單胞菌屬、無色菌屬、芽孢桿菌屬、小單胞菌屬等[10-12]都可以做成修復土壤石油污染的固定化菌。近年來，固定化微生物的研究正在興起，將會給微生物修復技術帶來革新性變化[7]。但是以往研究中對固定化降解菌的作用機理分析不夠。為此，該研究在對以往固定化微生物技術修復石油烴和其他有機污染效果和作用機理進行探討的基礎上，針對不同條件下的石油烴污染土壤，提出相應的微生物固定化方法，以期推動固定化微生物技術的應用。

1 固定化微生物技術及材料

1.1固定化微生物技術固定化微生物技術興起于20世紀60年代，主要由固定化酶技術發展起來[13]，固定化微生物的方式包括吸附法、包埋法、共價結合法、細胞交聯等[14]。固定化方式與載體材料和結構是決定固定化微生物性能的主要因素，現階段主要的固定化方式主要有吸附法、包埋法和交聯法等。各種固定化方法的性能如表1所示。吸附法和包埋法是目前最常用的2種方法[15]，其中吸附法的吸附作用包括物理吸附和離子吸附。物理吸附使用的是硅藻土[16]、活性炭[17]等具有高表面吸附能力的物質[18]。離子吸附是利用微生物帶電的表面特性，通過離子鍵將微生物固定于帶有相反電荷的固定材料上[15]。包埋法是將細胞分散到多孔載體內部，或利用高聚物形成凝膠時將細胞包埋在內部，從而達到固定細胞的目的[19]。交聯法是利用2個功能團以上的試劑直接與微生物細胞表面的反應基團進行交聯，形成共價鍵來固定微生物[18]。

1.2固定化載體材料固定化載體材料的主要作用是為微生物提供適宜生存的微環境，不同的原料及不同的制備方法與工藝生成的材料性能各不相同[20]。載體的比表面積、孔隙大小、結構是選擇固定化材料的主要依據，這些因素顯著影響微生物負載量[21]。

表1 不同固定化方法的性能

固定化材料總體上可分為人工合成材料和天然材料。人工合成材料主要為各種高分子聚合物，如聚丙烯酰胺和聚氨酯等[22]。由于部分合成高分子材料的生物毒性及環境不兼容等問題，這類材料在應用于原位土壤修復時往往受到質疑而難以廣泛應用。目前應用比較多的是各種天然材料或改性天然材料[23]，如炭質材料[24]、木屑[25]和改性植物秸稈[24]等，這些材料可以用于污染土壤的原位修復而不用考慮回收問題。生物炭作為載體材料，可以發揮其降低土壤的密度、提高土壤的持水力、改良土壤性質、增強土壤肥力等優勢[27-28]。在脫水干燥和儲存過程中，天然材料更有利于保持細胞活性[14]。載體材料的孔隙度、比表面積和表面化學特性都會影響微生物負載量，通過改性可以改變載體表面的官能團等[29]，改性后的載體負載降解菌，污染物的去除效率也得到提高。載體材料的改性方式包括酸改性或者堿改性[30-31]、鹽改性(如氯化鐵改性，硫酸亞鐵和碳酸鈣改性)[32]等。表面活性劑有時也作為制備固定化微生物的助劑，但表面活性劑一定程度上降低了固定化微生物對污染物的降解效率[33]，且一般化學表面活性劑具有殺菌作用，因而表面活性劑改性對微生物的作用還存在爭議。從生物質中直接提取的黃腐酸可以起到表面活性劑的作用[34]，且黃腐酸直接來源于生物質，不會影響微生物活性，黃腐酸[35]以及其它生化腐殖酸[36]已經被證實對土壤中多環芳烴和石油烴的去除有相當的貢獻作用,因而這些腐殖酸可能會代替化學合成表面活性劑作為制備固定化微生物的助劑。

1.3固定化工藝吸附法制作固定化微生物工藝：將載體經過滅菌處理后，與一定濃度待固定降解菌液按設計比例混合，共同培養一段時間，微生物通過氫鍵、范德華力、電荷間作用力、疏水相互作用力等吸附在載體的表面[37-39], 然后將菌液離心，將吸附微生物的載體與菌液分離，再將分離出的固定化微生物根據其保存條件要求保存在一定溫度和濕度的容器中待用。交聯法與包埋法具有一定的相似性，主要區別在于交聯法需要用2個功能基團以上的試劑作為交聯劑將微生物與載體通過形成共價鍵進行聯結，戊二醛是常用的交聯劑。交聯法的工藝是將交聯劑、包埋劑按一定比例與微生物混合均勻，靜置一段時間使交聯反應完成，然后將混合液通過蠕動泵或注射器滴加到高價離子溶液如氯化鈣中使混合了微生物的包埋劑凝聚成小球[40-41]，保存于一定的溫度和濕度條件備用。包埋法與交聯法的區別在于包埋過程中不加入交聯劑，直接將包埋劑與微生物混合均勻后，再滴入高價離子鹽團聚成微球[42]。

2 固定化微生物對土壤中石油污染物的降解效果

目前，固定化微生物技術在土壤修復中的現場應用還比較少，但已經有相當數量的實驗室研究，表2是現有研究中固定化微生物對土壤中石油污染物的去除率統計。

從表2可以看出，絕大部分載體材料選用炭質或硅質多孔材料作為吸附劑吸附降解菌，部分選用殼聚糖、結冷膠2種材料包埋降解菌。大部分固定化降解菌對污染物的降解速率顯著高于游離菌。例如，以聚氨酯泡沫為載體吸附芽孢桿菌屬，用于填充床生物反應器降解土壤中的苯，苯去除率達到90%，而游離菌屬的降解率僅為70%[48]；且部分固定化材料可以與降解菌協同作用增加石油污染物的去除率，如黏膠基氈狀活性炭纖維固定石油降解菌試驗中，油污的降解效率顯著高于游離菌[44]。固定化降解菌還可以降解游離菌不能去除的物質，如生物炭固定化微生物修復多環芳烴污染土壤時，固定化降解菌可以降解游離菌不能降解的熒蒽和芘[33]。固定化的微生物可以重復利用，極大程度地降低成本。采用生物大分子仿生合成納米多孔SiO2作為載體，負載石油降解菌，用于土壤試驗，發現固定化微生物在50 h內降解率達到96.2%，降解率高于游離菌30%，重復利用8次后降解率仍在85%以上[45]。混合材料作為固定化載體，在提高石油污染物降解率的同時，還增加固定化小球的強度，也為提高重復利用率而做出貢獻:將海藻酸鈉和硅藻土混合作為載體，石油降解率可以提高8.6%[17]；以海藻酸鈉和活性炭進行交聯作為載體，固定降解菌，降解土壤中的菲和芘，240 h之后固定化細菌對菲和芘的降解率分別高于游離菌37.04%和20.85%[46]；利用活性炭和海藻酸鈉混合材料作為載體，當活性炭含量為0.8%時，破損率最低，滲透性最好，同時提高了石油降解菌的耐鹽性[47]。固定化微生物技術還可以顯著縮短微生物遲滯期，結冷膠固定微生物降解汽油時，與游離微生物相比，在5 d內相同濃度的微生物在固定化條件下對汽油的降解率達到90%，而游離微生物在30 d后才達到其最高水平，且汽油的去除率低于固定化降解菌[48]。

3 固定化微生物技術提高污染物降解率的機理

以黑色不規則圖形代表土壤顆粒，灰色不規則圖形代表固定化微生物載體，加入載體后，可以使土壤孔隙度增加,多孔載體可以提高氧氣的傳遞速率(圖1a)；對放大的微生物載體，帶環長鏈代表石油烴大分子，不同形態的細菌代表不同石油烴降解菌；N、P、K營養物質以分子式表示，載體對降解菌的作用可以歸結為：①載體內部具有孔隙結構，降解菌群存在于載體內部的孔隙中，可以避免外界不良因素的影響；②不同的降解菌可以發揮協同和共代謝的作用；③載體材料本身含有的或者額外施加的營養元素，可以直接供給降解菌吸收，促進降解菌的生長；④石油烴分子吸附于載體表面或者孔隙中，增加降解菌與它的接觸機率，從而提高降解效率(圖1b)。

3.1利用載體屏蔽外界不良環境因素由于土壤環境的復雜性及污染物的高毒性，使得游離微生物的降解效率低。固定化載體可以為微生物提供相對舒適的微環境[49]，從而提高微生物的降解效率；固定化載體有大量的孔隙，比表面積大，可負載大量微生物[50]，幫助微生物抵制外界的毒性干擾，降低外界環境的抑制作用，可以大量縮短降解菌的適應期[25,49]，為菌群大量繁殖提供基礎。

表2 固定化微生物對土壤中石油污染物的去除率

圖1 固定化微生物降解石油烴機理Fig.1 Degradation machanism of petroleum hydrocarbons by immobilized microbes

3.2固定化載體的吸附作用污染物的低生物可利用性[51]是限制微生物降解速率的步驟之一；利用載體對石油污染物的吸附作用[52]，可以增大污染物與微生物的接觸機會，提高目標污染物的降解率。如黏膠基氈狀活性炭纖維固定石油降解菌試驗中，活性炭纖維的物理吸附與微生物降解作用相結合，使油污的降解效率顯著高于游離菌[43]；如選擇BET比表面積大的生物炭固定耐鹽棒狀桿菌降解石油烴時，固定化微生物對目標污染物的降解率最高，可以達到79.4%[53～54]。

3.3提高微生物活性及酶活性惡劣環境造成的低生物活性和酶促反應速率低是生物修復的限速步驟，固定化載體可以提高微生物活性及酶活性，抵消由于溫度低對微生物活性限制的影響[52,55,57-58]，石油污染物在降解過程中，一系列的加氧酶、羥化酶起著最重要的作用，而不同的脫氫酶、多酚氧化酶等對底物加氧后的代謝起著更重要的作用[59]。固定化微生物的酶活性及代謝活性比游離微生物高，如海藻酸鈉和硅藻土3∶1混合作為負載材料，負載微生物比游離菌的生物活性高[17]；在竹炭負載微生物降解苯酚污染土壤試驗中，添加固定化菌的土壤中多酚氧化酶、脲酶的活性以及微生物的多樣性可以恢復到未污染土壤中的酶活性水平[60]；這與Patil等[50]研究結果一致，固定化菌在毒性環境中，相對游離菌更容易繁殖；高溫裂解松木形成的生物炭作為載體負載下水道腸桿菌屬，通過定量PCR獲得土壤中綠色熒光蛋白的數量，發現固定化微生物存活率顯著高于游離菌，這是由于生物炭中合適的N含量、pH、比表面積、持水力等都適合微生物繁殖后代，在苯作為唯一碳源的情況下，固定菌對苯的利用率遠高于游離菌[61]。

3.4為微生物提供營養元素部分固定化載體可以為降解菌提供一定的營養元素，以殼聚糖作為載體固定化降解菌時，因殼聚糖本身含有碳源，起到固定化作用的同時，還可以起到生物刺激的作用，促進土著降解菌的生長[62]。

3.5提高土壤中氧氣和水分子的傳遞速率載體具有多孔性結構，對水分子也有強烈吸附性，施入土壤中，有效增加土壤孔隙度，同時提高土壤中氧氣的含量，氧氣濃度是未施加載體土壤中氧氣濃度的數倍，且倍數隨土壤深度增加[63]。

3.6其他機理改性后的載體材料會提高微生物對污染物的降解效率。利用氫氧化鈉和過氧化氫對花生殼進行改性，破壞花生殼纖維素中的苯環，增加花生殼的孔隙度，最終增加其負載降解細菌的數量，改性后的花生殼固定化菌對芘的降解率提高，且改性花生殼作為載體提高了微生物的活性[30]。但若過度改性，則對目標物的降解率沒有貢獻，推測原因可能是過度改變載體表面結構，使載體的吸附能力與降解菌的協同作用受到限制[26]。固定化微生物可以在載體吸附底物形成污染物膜的前提下生存[24]，同樣是高污染物濃度，游離微生物卻不能生存；也有研究認為固定化載體對污染底物的吸附，會限制降解菌的降解率[57]。

4 不同環境下固定化微生物技術的優化途徑

固定化技術通過多種機理提高降解微生物對土壤中石油污染物的降解性能，針對不同的土壤環境，可以選擇與其相適應的固定化技術，并對固定化方法進行優化。首先，載體材料的組成和結構對其降解效果起著至關重要的作用，要進一步開發能夠適應多種土壤環境、固定化微生物降解性能高的材料。其次，對復合降解菌組成的優化，添加適當濃度的營養元素，以及對固定化載體的表面進行改性也是重要的優化方向。以海面漏油污染的濱海潮間帶為例，影響海面漏油生物修復的主要原因有營養鹽、微生物及潮汐作用。潮汐作用會導致營養鹽、菌劑的流失，不能有效促進潮間帶砂層中石油污染物的降解，且造成局部海水富營養化等二次污染。以潮間帶環境特有的自然材料(如蝦加工廢料中殼聚糖鱗片及貝殼)固定耐鹽度高的微生物，添加交聯劑以減少微生物的擴散流失，施加緩釋營養鹽，避免營養鹽擴散流失及局部富營養化的出現[63-66]就是十分有效的優化方法。

5 結論與展望

固定化微生物技術在石油烴污染土壤修復方面具有獨特的優勢，運用較好的固定化技術負載的降解菌不僅降解效率顯著高于游離菌，還可以降解游離菌不能降解的污染物。

固定化載體提高降解效率的機理包括：①利用載體屏蔽不良環境條件；②固定化載體的吸附作用；③提高微生物活性及酶活性；④為微生物提供營養元素；⑤提高土壤中氧氣和水分子的傳遞速率等。

固定化微生物技術的很多影響因素(載體類型，固定化時間，粒徑大小，微生物種類，細胞密度及負載量)已經得到研究，但關于改善傳質速率、解釋相關基質擴散問題還有待進一步研究。截至現在，固定化微生物技術對石油污染土壤的修復仍局限于實驗室階段，只有很少一部分應用于生物反應器，未來更需要著眼于固定化微生物技術在石油污染場地的現場應用等方面的研究。