槲皮素通過SIRT1/ROS/DR5途徑提高TRAIL抗前列腺癌活性的研究

戴卓睿姜 凱

在男性群體中，前列腺癌是臨床上發(fā)病率占第二位的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅男性健康和生活質(zhì)量[1]。目前，對于早期前列腺癌，手術(shù)切除腫瘤組織是臨床上最有效的治療方法，但對于中晚期前列腺癌患者而言，由于癌細(xì)胞的擴散，患者需要進行系統(tǒng)性免疫治療或化療以提高其生活質(zhì)量和生存率[2-3]。腫瘤壞死因子誘導(dǎo)凋亡配體（tumor necrosis factor，TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL） 是一種屬于TNF超家族的細(xì)胞因子[4]，它能選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，卻不影響正常組織細(xì)胞的功能，因此TRAIL是一種有良好前景的新型低毒腫瘤治療藥物[5-6]。然而，很多患者體內(nèi)的前列腺細(xì)胞對TRAIL治療并不敏感[7]，因此聯(lián)合輔助治療藥物提高腫瘤細(xì)胞對TRAIL敏感性是改善其抗腫瘤治療的重要策略。

1 材料與方法

1.1 材 料 RPMI-1640培養(yǎng)基（批號11875085）購于美國Gibco。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（批號 APOAF）、N-乙酰半胱氨酸 （NAC）（批號1009005）、二氫乙啶（DHE）（批號 D7008）、噻唑藍(lán)（MTT）（批號 M2128）和槲皮素（批號 1592409）購于美國 Sigma-Aldrich。TRAIL（批號 P50591）購于美國R&D Systems。SIRT1 抗體（批號 #2493）、死亡受體 5（DR5）抗體（批號 #8074）、caspase-8（批號 #9746）、caspase-3抗體（批號#9665）和GAPDH抗體（批號#5174）購于美國Cell Signaling公司。增強型化學(xué)發(fā)光底物（ECL）試劑盒（批號32106）購于美國Pierce。脂質(zhì)體2000（批號11668019）購于美國Invitrogen。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人前列腺癌細(xì)胞系PC3（批號CRL-1435）購于美國模式培養(yǎng)物典藏所（ATCC）。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。

1.3 SIRT1質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 人SIRT1基因的開放閱讀框架序列經(jīng)PCR擴增后以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成SIRT1重組過表達(dá)質(zhì)粒。SIRT1過表達(dá)質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000按試劑操作說明書步驟進行轉(zhuǎn)染，簡要步驟如下：將2μg/mL質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000進行包裹后將其加入到無血清培養(yǎng)基進行混合。將貼壁的PC3細(xì)胞置于該無血清培養(yǎng)基孵育6h后棄去無血清培養(yǎng)基并加入新鮮的含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。

1.4 細(xì)胞活力檢測 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的PC3細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對照組、槲皮素組、TRAIL組，TRAIL+槲皮素組，TRAIL+槲皮素+SIRT1質(zhì)粒組和TRAIL+槲皮素+NAC組。對照組為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48h，TRAIL組為在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞中加入2μmol/L的TRAIL培養(yǎng)48h，槲皮素組為在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞中加入10μmol/L的槲皮素培養(yǎng)48h，TRAIL+槲皮素組為在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞中加入2μmol/L的TRAIL和10μmol/L的槲皮素培養(yǎng)48h，TRAIL+槲皮素+SIRT1質(zhì)粒組為在SIRT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞中加入2μmol/L的TRAIL和10μmol/L的槲皮素培養(yǎng)48h，TRAIL+槲皮素+NAC組為在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞中加入 2μmol/L 的 TRAIL、10μmol/L 的槲皮素和2mmol/L NAC培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后在PC3培養(yǎng)孔中加入20μL 5mg/mL MTT再培養(yǎng)4h，小心吸去上清液，往孔中加入150μL二甲亞砜，充分震蕩后在570nm波長下用酶標(biāo)儀檢測OD值，PC3細(xì)胞活力抑制率用以下公式計算：抑制率=（OD對照組-OD藥物處理組）/OD對照組×100%。

1.5 細(xì)胞凋亡實驗 對PC3細(xì)胞按上述進行分組處理。處理完畢后按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書用Annexin-V對細(xì)胞進行染色孵育20min。之后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測PC3細(xì)胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比表示。

1.6 ROS測定 對PC3細(xì)胞按上述進行分組處理。藥物處理完畢后在PC3細(xì)胞中加入5μmol/L DHE暗室孵育20min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測PC3細(xì)胞中ROS的水平。紅色熒光越強則ROS水平越高[8]。

1.7 Western blot實驗 對PC3細(xì)胞按上述進行分組處理。藥物處理完畢后將細(xì)胞用蛋白提取液提取總蛋白質(zhì)。之后將提取的總蛋白質(zhì)用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到醋酸纖維素膜上，用SIRT1抗體、DR5 抗體、caspase-8、caspase-3 抗體和GAPDH抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示并用SPSS14.0統(tǒng)計分析軟件進行處理，組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析（ne-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素輔助治療提高PC3細(xì)胞對TRAIL的敏感性 MTT和流式細(xì)胞實驗結(jié)果顯示，TRAIL+槲皮素組PC3細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率均顯著高于TRAIL單治療組和槲皮素單治療組（P＜0.05），見表1，表明槲皮素輔助治療能顯著提高前列腺癌細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)的凋亡的敏感性。

2.2 槲皮素抑制PC3細(xì)胞SIRT1表達(dá)提高其對TRAIL治療的敏感性 Western blot實驗結(jié)果顯示，TRAIL處理對PC3細(xì)胞SIRT1的表達(dá)水平無影響，而槲皮素處理能明顯抑制PC3細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平（圖1）。為了研究槲皮素發(fā)揮對TRAIL增效作用的機制是否和SIRT1表達(dá)的下調(diào)有關(guān)，筆者在PC3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SIRT1質(zhì)粒使SIRT1蛋白強制高表達(dá)。實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SIRT1質(zhì)粒能顯著降低PC3細(xì)胞在槲皮素和TRAIL聯(lián)合治療下的細(xì)胞活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率（表1），表明槲皮素通過抑制前列腺癌細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)水平增強TRAIL對前列腺癌細(xì)胞的殺傷活性。

圖1 槲皮素和TRAIL對PC3細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平的影響

表1 槲皮素和TRAIL對PC3細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制率和凋亡誘導(dǎo)率的影響（%，x±s）

2.3 槲皮素通過SIRT1/ROS/DR5途徑提高TRAIL對PC3細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性 流式細(xì)胞實驗結(jié)果顯示，槲皮素能顯著增強TRAIL對PC3細(xì)胞ROS的誘導(dǎo)產(chǎn)生，但轉(zhuǎn)染SIRT1質(zhì)粒后，槲皮素不能促進ROS的產(chǎn)生（圖2），表明槲皮素能通過抑制SIRT1表達(dá)促進TRAIL依賴的ROS的生成。Western blot實驗結(jié)果顯示，槲皮素聯(lián)合TRAIL顯著誘導(dǎo)PC3細(xì)胞DR5的高表達(dá)，但用SIRT1質(zhì)粒或ROS清除劑NAC[9]處理后，槲皮素不能促進DR5的表達(dá)（圖3），表明DR5受SIRT1/ROS途徑的調(diào)控。同時，槲皮素聯(lián)合TRAIL能顯著誘導(dǎo)PC3細(xì)胞caspase-8和caspase-3的活化，而轉(zhuǎn)染SIRT1質(zhì)粒或采用NAC處理均能抑制這些caspases的活化（圖3）和凋亡的發(fā)生（表1），表明槲皮素通過SIRT1/ROS/DR5途徑提高TRAIL對PC3細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性。

圖2 TRAIL和槲皮素對PC3細(xì)胞ROS產(chǎn)生水平的影響

圖3 槲皮素促進DR5表達(dá)和caspase-8、caspase-3活化

3 討論

槲皮素是一種天然黃酮類化合物，有很好的抗氧化和抗炎作用。近幾年的研究表明，槲皮素還有一定的抗腫瘤效應(yīng)，文獻[10]報道槲皮素能抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移；槲皮素還能通過損傷肺癌細(xì)胞的細(xì)胞骨架而發(fā)揮抗腫瘤活性[11]。文獻[12-14]報道中藥活性成分在化療中能起到較好的協(xié)同作用，如雷公藤紅素能抑制抗凋亡蛋白Bcl-w和PKM2的表達(dá)降低宮頸癌及肝癌細(xì)胞的化療耐藥性，歐前胡素能通過抑制口腔癌細(xì)胞中MCL-1的表達(dá)增強順鉑對其的殺傷活性，說明中藥活性成分的聯(lián)合治療可能是提高化療療效的一個重要策略。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素聯(lián)合處理能顯著提高前列腺癌細(xì)胞在TRAIL治療下的細(xì)胞活力抑制率和凋亡率（P＜0.05），表明槲皮素能作為一種輔助治療藥物增強TRAIL對前列腺癌細(xì)胞的殺傷活性，發(fā)揮對TRAIL的協(xié)同作用，降低前列腺癌對TRAIL的抵抗性。

研究[15-16]表明，TRAIL能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，它能與腫瘤細(xì)胞表面的DR5發(fā)生結(jié)合，從而激活caspase-8依賴的外源性凋亡通路，進而活化caspase-3，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡性死亡。因此，腫瘤細(xì)胞表面DR5的表達(dá)水平?jīng)Q定了其對TRAIL治療的敏感性。SIRT1屬于組蛋白去乙酰化酶蛋白家族成員。研究[17-18]表明，SIRT1的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性有關(guān)，腫瘤組織SIRT1表達(dá)越高則藥物治療的療效越差，因此SIRT1已成為腫瘤治療的一個重要靶點。在SIRT1信號通路中，ROS發(fā)揮了重要作用，SIRT1能清除細(xì)胞中的ROS[19]。有文獻[20-21]報道腫瘤細(xì)胞中的ROS能誘導(dǎo)DR5的高表達(dá)，因此腫瘤細(xì)胞中SIRT1的高度表達(dá)能抑制TRAIL對ROS的誘導(dǎo)生成，從而減少DR5的表達(dá)而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生對TRAIL的抵抗性。

本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素在前列腺癌細(xì)胞中的直接靶點是SIRT1蛋白，槲皮素輔助治療能顯著降低腫瘤細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)水平，當(dāng)在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SIRT1質(zhì)粒強制增加它的表達(dá)水平后，槲皮素對TRAIL的協(xié)同抗前列腺癌活性受到明顯抑制。另外，筆者發(fā)現(xiàn)槲皮素能明顯促進TRAIL依賴的ROS的產(chǎn)生及其下游DR5的表達(dá)，而在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SIRT1質(zhì)粒強制增加它的表達(dá)水平后，槲皮素對ROS產(chǎn)生和DR5表達(dá)的促進作用受到明顯抑制，表明槲皮素能通過SIRT1/ROS/DR5途徑發(fā)揮對TRAIL的協(xié)同抗前列腺癌活性。