生理性衰老小鼠的感染免疫模型建立

袁松華，傅衛(wèi)輝，何涌泉，徐建青,2，張曉燕,2*

(1.復旦大學附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508； 2.復旦大學生物醫(yī)學研究院，上海 200032)

美國疾病預防控制中心發(fā)布的關于1976—2007年度全美流感病例報告顯示，每年65周歲及以上的老年人群中每10萬人的發(fā)病人數(shù)約為321.1，而18～64周歲的成年人群里每10萬人的發(fā)病人數(shù)僅為39.9[1]。更為嚴重的是，因流感及流感樣癥狀死亡的數(shù)量每年超過3.6萬，其中89.1%是65周歲及以上老年感染者[2]。由此可見，老年人群是流感病毒感染風險系數(shù)最高的年齡組群。與年輕人群相比，老年感染者的癥狀更加嚴重，誘發(fā)慢性肺阻塞性疾病，充血性心力衰竭，哮喘以及心肌梗塞等慢性合并癥[3]。即使體內(nèi)流感病毒已經(jīng)清除，一些重癥的老年感染者會部分甚至全部喪失自主的日常生活能力[4-5]。因此，流感病毒感染老年人群引發(fā)的經(jīng)濟學和社會學問題，已經(jīng)成為威脅公共衛(wèi)生安全的重要挑戰(zhàn)。

在流感病毒感染的極早期，老年感染者對體溫升高重視不夠，因流感樣癥狀收治入院時間相對滯后。另外，重癥流感的老年病患臨床特點主要為，病程進展速度快，感染后易出現(xiàn)多種并發(fā)癥，感染后致死率較高[6]。研究標本采集主要集中于外周血和咽拭子等。但肺內(nèi)原位炎癥、病理變化以及淋巴歸巢應答研究等更深層次的機制研究，受標本取材、倫理等因素制約難以收集。此外，已經(jīng)獲批的特異性針對老年人群的有效流感抗病毒藥物、流感疫苗的種類較少，現(xiàn)有抗病毒藥物[7]或三價滅活疫苗的保護效果有限[8]，一個科學的用于藥物或疫苗有效性評估的動物模型是必需的。以上各種現(xiàn)實挑戰(zhàn)亟待一個穩(wěn)定可靠，同時具備一定擬合度的動物模型，用于研究老年流感病毒感染免疫應答。近交系小鼠模型是免疫學研究重要工具，遺憾的是，現(xiàn)有的研究關于老齡近交系小鼠流感感染免疫模型的報道并不明確。因此本課題組以流感病毒H9N2為模式病原，分別從體重變化、生存曲線、肺內(nèi)病毒復制、肺內(nèi)炎癥因子表達以及肺的病理損傷情況等幾個方面進行全面闡述，建立老年近交系C57小鼠的感染免疫模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗小鼠均選用SPF級別雌性C57小鼠，6～8周齡(18～19 g)和8月齡(22～24 g)各30只，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[SCXK(滬)2013-0016]。8月齡小鼠在上海市公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物部SPF區(qū)域[SYXK(滬)2015-0008]繼續(xù)飼養(yǎng)至18～24月齡(28～30 g)。

1.2 流感病毒

H7N9、H9N2病毒經(jīng)MDCK細胞和雞胚培養(yǎng)滴定后，-80℃儲存?zhèn)溆谩嶒灳趧游锷锇踩墝嶒炇?ABSL-3)中進行。[高致病性病原微生物實驗室資格證書編號為衛(wèi)BSL3-007；中國合格評定國家認可委員會實驗室認可證書編號NO.CNAS BL0016]，研究方法經(jīng)過上海市公共衛(wèi)生臨床中心動物倫理委員會審查(編號為：2014倫審K007號)。

1.3 實驗方法

1.3.1 老年小鼠流感病毒感染模型

受試小鼠提前24 h轉(zhuǎn)入生物安全實驗室適應，分為老年感染組、成年感染組、老年未感染對照組以及成年未感染對照組共計4大組，每組小鼠10只。小鼠腹腔注射100 μL 1%戊巴比妥鈉溶液全身麻醉，5×106EID50H9N2或3.5×105TCID50H7N9流感病毒經(jīng)鼻腔攻擊，記錄各組小鼠感染后連續(xù)14 d的體重變化、生存情況。

1.3.2 石蠟切片蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE) 染色

將肺組織在10%的福爾馬林溶液，靜置固定24 h，包埋于石蠟中。蠟塊制備為10 μm切片(白片)數(shù)張備用。60℃烤片1 h，依此在二甲苯，無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇依次浸泡脫蠟3～5 min，PBS洗滌，蘇木精染色5 min，自來水洗去蘇木精染液，0.5%伊紅染液染色1 min，自來水洗脫，85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯依次脫水3 min，晾干，封片。切片由奧地利Tissue Gnostics類流式組織定量細胞分析儀拍攝分析。

1.3.3 炎癥-趨化因子檢測

收集感染急性期內(nèi)(第1、2、3、7天)小鼠肺內(nèi)灌洗液和外周血，肺灌洗液4℃，12 000 r/min離心5 min，分裝上清，將外周血混入抗凝劑(3.8%枸椽酸鈉溶液與全血1∶9混合)重復混勻，3000 r/min離心10 min，分裝上清。分別取50 μL肺灌洗液、血漿和梯度稀釋后標準品，依次加入50 μL預混多因子磁珠，50 μL PE標記的熒光染色溶液，室溫避光孵育2 h。200 r/min離心5 min，用試劑盒內(nèi)專用的洗滌緩沖液洗1次，最后每管標本終體積為100 μL。全部標本由美國BD公司的LSR Fortessa多色流式細胞儀分析獲取數(shù)據(jù)。

注：圖中黑色實線表示老年小鼠感染H7N9或H9N2流感病毒或者未感染后體重變化，圖中虛線表示同等流感病毒感染條件下，成年對照小鼠體重變化。計算依據(jù)：體重變化=(時間點體重-初始體重)/初始體重×100%。

1.3.4 肺內(nèi)流感病毒載量測定

分別在感染急性期內(nèi)(第1、2、3、7天)小鼠肺組織，含10%FBS的1640培養(yǎng)液洗滌2次，每只小鼠取2 g組織，加入1 mL Trizol裂解液、直徑1 mm小鋼珠2粒，60 Hz超聲破碎60 s，超聲2次，組織懸液12 000 r/min 離心5 min，收集上清后，混入等體積的去離子水，劇烈振蕩15 s，室溫靜置10 min。12 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入500 mL異丙醇，室溫靜置10 min，12 000 r/min離心5 min，再次棄上清，500 mL75%乙醇洗滌1次，2000 r/min離心5 min，再次棄上清，RNA沉淀溶于100 μL的無RNA酶的去離子水中。RNA定量后，取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用SYBR試劑進行Real-time PCR擴增H9N2、GAPDH的序列。全部樣品由德國Eppendorf公司的Realplex 4熒光定量PCR儀分析獲取數(shù)據(jù)。擴增程序：42℃，10 min；95℃，1 min；95℃，15 s；60℃，45 s；45個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 與H7N9病毒相比，H9N2病毒感染老年小鼠體重變化和生存變化

在未感染的條件，兩組小鼠體重波動在14 d內(nèi)不超過5%(圖1)，作為環(huán)境對照可以確保研究環(huán)境是穩(wěn)定安全的，影響小鼠的體重變化的單一因素是流感病毒的感染。感染H7N9流感病毒的老年小鼠體重下降速率快(圖1)，感染后第7天體重下降超過30%(成年對照22%，兩組曲線無顯著性差異)，另一組老年小鼠感染H9N2流感病毒后前7天內(nèi)迅速下降至25%左右，組內(nèi)成年對照體重下降不超過10%，具有顯著性差異(圖1)。

進一步分析生存情況，感染H7N9的老年小鼠第5天死亡50%，第11天全部死亡(圖2)，而成年對照第8天死亡50%，第14天死亡在90%，兩組小鼠的死亡速率和程度相近。H9N2感染模型生存終點顯示，老年小鼠在感染死亡50%，成年對照無死亡(圖2)。對比老年小鼠在H7N9和H9N2流感病毒感染過程中體重變化和生存情況，最終認定老年小鼠感染H9N2的流感感染模型更擬合臨床感染實際情況。

2.2 感染H9N2流感的老年小鼠肺內(nèi)病毒復制失控，肺內(nèi)炎癥表達變化

感染H9N2流感病毒后，老年小鼠肺內(nèi)病毒復制在第2天達到峰值(每克肺內(nèi)RNA病毒拷貝為3.2×104)(圖3)，第3天至第7天，肺內(nèi)的流感病毒逐漸清除。在感染后第1、2、3和7天四個時間點，老年小鼠肺的病毒復制情況均顯著高于成年對照(P< 0.001)。與成年對照相比，老年小鼠肺內(nèi)流感病毒復制控制能力更弱。

注：圖中黑色實線表示老年小鼠感染H7N9或H9N2流感病毒后生存情況，虛線代表同等感染條件下成年小鼠對照。

注：圖中四組bar依次代表小鼠感染H9N2病毒后第1、2、3和7天共計4個時間點肺內(nèi)流感病毒相對載量拷貝。與成年對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01,***P< 0.001。

在感染后第1、2、3和7天四個時間點，收集100 μL肺泡灌洗液，檢測具代表性的6類炎癥-趨化因子。結果發(fā)現(xiàn)老年小鼠肺內(nèi)炎癥因子IL-6、趨化因子MCP-1急劇升高，在感染后第2天達到峰值，均超過4000 pg/mL，第3天至第7天炎癥因子表達逐漸下降(圖4a)。成年對照肺內(nèi)炎癥表達相對適度，峰值均未超過1000 pg/mL，感染后第3天迅速恢復至基線水平(圖4b)。將峰值點的炎癥-趨化因子分類分析發(fā)現(xiàn)，老年小鼠肺內(nèi)炎癥主要以炎癥因子IL-6和趨化因子MCP-1為主(圖4c)，而成年小鼠肺內(nèi)炎癥因子包括炎癥因子TNF-α、IL-6以及負調(diào)控因子IL-10(圖4d)。

2.3 感染H9N2流感的老年小鼠肺內(nèi)損傷情況和修復時間

在未感染的條件下，相比與成年對照，老年小鼠的肺泡增大，致密性更低。感染H9N2病毒第1天，老年小鼠肺內(nèi)出現(xiàn)大量的炎性細胞，肺泡壁開始增厚，肺泡結構少量出現(xiàn)破損，在第2、3天，肺泡結構嚴重破環(huán)，大量紅細胞滲入肺間隙，大量肺泡壁增厚。感染后第7天，肺泡結構部分修復，尚有大量的炎性細胞和少量的紅細胞滯留在肺間隙內(nèi)。感染H9N2病毒后，成年小鼠肺內(nèi)出現(xiàn)適量的炎癥細胞侵潤，但肺泡結果相對完整。感染后第7天，肺泡結構修復良好，肺內(nèi)炎性細胞很少潴留或幾乎沒有(圖5a)。

根據(jù)文獻中的評分體系(表1)[9]，對兩組小鼠的肺內(nèi)動態(tài)病理損傷情況進行定量分析。統(tǒng)計結果提示老年小鼠感染H9N2病毒后第1、2、3和7天，肺組織損傷評分均顯著高于成年對照(圖5b)。感染后第7天，老年小鼠肺內(nèi)損傷沒有完全修復，成年小鼠肺內(nèi)損傷修復良好。

注：圖a、b依次代表小鼠感染H9N2病毒后第1、2、3和7天共計4個時間點肺內(nèi)灌洗液中多個炎癥-趨化因子動態(tài)變化。圖c、d代表感染后第2天(炎癥表達峰值時間點)肺內(nèi)炎癥-趨化因子的組成比例。左側圖a、c為老年小鼠，右側圖b、d為成年對照，分別檢測了第0，1，2，3，7天5個時間點。

表1 肺組織病理檢查評分系統(tǒng)

Table 1 Scoring system for histopathological examination of lung tissue

參數(shù)Parameter描述Interpretation打分Score肺泡細胞數(shù)量Inflammation無No inflammatory cells in alveolar00～5個細胞0-5 cells in alveolar15～10個細胞5-10 cells in alveolar2>10個細胞>10 cells in alveolar3肺泡壁水腫程度Edema無Absent0肺泡壁增厚Increased swelling of alveolar walls1肺泡壁增厚:纖維蛋白滲出Increased swelling of alveolar walls and fibrinous2大量肺泡壁增厚:纖維蛋白滲出Widespread swelling of alveolar walls and fibrinous3紅細胞滲出數(shù)量Hemorrhage<5個紅細胞<5 erythrocytes in alveolar05～10個紅細胞5-10 erythrocytes in alveolar110～15個紅細胞10-15 erythrocytes in alveolar2>15個紅細胞>15 erythrocytes in alveolar3肺泡破損程度Atelectasis無Absent0小面積肺不張Small atelectasis areas involved1大面積肺不張:形成1～5小葉Large atelectasis areas and some lobules involved2形成>5個小葉Several lobules involved3

注：上行顯示的是老年小鼠在感染H9N2后第0、1、2、3和7天共計5個時間點的肺組織HE染色結果，下行顯示的是成年小鼠在H9N2感染過程中對應時間點的肺HE染色結果。

注：根據(jù)美國胸科醫(yī)師協(xié)會官方雜志Chest中關于急性肺損傷模型報道，擬定肺病理損傷的評判標準分為肺泡內(nèi)外炎性細胞數(shù)量，肺泡壁水腫程度，紅細胞滲出數(shù)量以及肺泡破損嚴重程度四個方面，每一項目依據(jù)損傷的輕重程度，依次計分為0～3分。小鼠肺組織損傷最終得分四個項目得分之和，結果得分越高，代表肺損傷越嚴重。

3 討論

部分研究選用基因組DNA片段錯誤編輯產(chǎn)生的基因型早衰小鼠[10]或化學試劑如D-半乳糖處理產(chǎn)生的誘導型早衰小鼠模型[11]，這類模型小鼠的生理學特征是出生后數(shù)周內(nèi)，機體表現(xiàn)出臟器老化、免疫衰老等的老年癥狀。這些人工促衰老模型，會出現(xiàn)部分共性衰老特征，然而與生理性衰老模型具有顯著的區(qū)別[12]。生理性衰老的宿主具有胸腺輸出能力不足、體液抗體分泌能力下調(diào)以及免疫細胞表面受體多樣性縮減的免疫衰老的特征[13]，如果選用人為衰老小鼠作為研究對象，不能科學地模擬老年宿主感染現(xiàn)狀。因此，本課題組選用的生理性衰老，月齡為國際標準的18～24月[14]，一直生活于SPF級環(huán)境的近交系C57小鼠。該模型小鼠的主要免疫學特點是體內(nèi)不含特定病原體，同時免疫性質(zhì)高度一致，適合免疫學群體的研究和評價。本課題組選用C57小鼠感染流感病毒，建立合適的病毒感染模型，主要評價感染后免疫應答，有助于解析老年宿主體內(nèi)病理學、免疫學相關機制。

從病原學角度分析，H7N9流感病毒屬于2013年中國東部出現(xiàn)的新發(fā)的高致病性禽流感病毒，其中6/8的基因組片段重組來源于東亞地區(qū)家禽、水鳥類中普遍潛伏的野生型低致病性H9N2禽流感病毒[15]。H7N9[16]、H9N2[17]病毒的攻毒劑量標準均參照前期成年小鼠感染模型中等同劑量。高致病性H7N9流感病毒感染后，兩組不同月齡的小鼠體重下降速率和死亡情況的差異較小，與臨床感染情況不符合。本課題組嘗試梯度稀釋10倍，發(fā)現(xiàn)老年小鼠感染后，第7天開始出現(xiàn)死亡，第14天組內(nèi)小鼠全部死亡，體重下降速率和生存曲線類似，病理癥狀出現(xiàn)由感染后第1天，調(diào)整至第7天(數(shù)據(jù)未顯示)。老年小鼠感染H9N2流感病毒后7天內(nèi)，體重下降20%以上，死亡達到50%，與6～8周成年C57小鼠有顯著區(qū)別。因此，本課題組認為H9N2流感病毒更適合老年小鼠流感病毒感染模型的病原。

2013年收治入院的H7N9流感病毒感染者臨床研究發(fā)現(xiàn)，65周歲以上的老年人占比為72.2%(13/18)，死亡率為22.2%(4/18)，均高于成年人的住院率27.8%和死亡率11.1%[18]。年齡和恢復時間進行線性回歸統(tǒng)計，結果顯示隨著年齡越大，感染恢復(住院天數(shù))時間越長，呈顯著正相關回歸關系(P=0.0194)。另外在感染者血漿炎癥動態(tài)學分析發(fā)現(xiàn)[19]，老年感染者外周血中炎癥因子IL-6(> 80 pg/mL)，趨化因子IL-8(> 60 pg/mL)的分泌水平顯著高于成年對照(P=0.003，P=0.03)，絕對數(shù)值超過基線水平的10倍以上。肺組織病理切片同時清晰提示了H7N9老年感染者肺泡細胞壁增厚，肺泡間隙進一步被壓縮，更多的炎性淋巴細胞趨化至病灶，肺損傷程度甚于成年。從模型可以看出老年小鼠組的體重下降速率、生存率，前7天肺內(nèi)病毒控制情況，肺灌洗液中炎癥因子的表達均顯著高于成年對照，更符合臨床實際情況。

重癥流感的老年感染者臨床突出表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難以及上呼吸感染等，早期診斷主要評價呼吸頻率、心率增快，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素為指標的肝功能異常，血小板計數(shù)降低等常規(guī)生化指標。但是由于老年感染者的臨床表現(xiàn)與炎癥指標相對不特異，現(xiàn)有臨床指標正常值范圍均基于健康成年人群界定的。本課題組通過18～24月齡的老年C57小鼠H9N2流感病毒感染模型，在感染期重現(xiàn)了老年宿主發(fā)病率、死亡率更高的臨床現(xiàn)象。在急性感染期，發(fā)現(xiàn)老年宿主肺清除流感病毒的能力更弱，肺內(nèi)炎癥因子IL-6、趨化因子MCP-1更高水平，感染后肺組織損傷程度更為嚴重。因此，本課題組成功建立老年小鼠感染免疫模型，以肺內(nèi)炎癥因子IL-6和趨化因子MCP-1為特異性早期免疫指標評估老年宿主感染病毒后肺內(nèi)病毒清除情況以及肺臟損傷與修復情況。