正常巴馬小型豬與高血糖家系F 5代血液生理生化指標比較研究

鄧俊成，蘇小華，呂 明，王 超，顧為望,*

(1.南方醫科大學實驗動物中心，廣州 510515； 2.廣東醫科大學， 東莞 523808； 3.東莞松山湖明珠實驗動物科技有限公司， 東莞 523808)

糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病，表現為胰島素分泌不足或作用缺陷引起的代謝紊亂。有調查顯示，我國成人糖尿病的患病率估計為10.9%，糖尿病前期的流行率估計為35.7%[1]。目前，還沒有能根治糖尿病的方法，只能通過多種手段對糖尿病的病情進行控制。小型豬由于在代謝機制、糖類吸收和利用、胰腺發育和形態等方面與人類的極其相似[2]，而且豬的胰島素只有一個氨基酸與人的不同，因此非常適合作為研究糖尿病的實驗動物?，F在用于制作小型豬糖尿病模型的主要方法有STZ法、飲食誘導法或者以上兩者結合的方法，但造模過程較為繁瑣。在實驗小型豬的培育過程中，本課題組篩選出一頭有高血糖表現的巴馬小型豬公豬2907，用這頭公豬作為種公豬，以近親交配的方式組建家系，至今已培育至F 5代。本研究旨在對正常巴馬小型豬和高血糖家系F 5代個體的血液生理生化指標進行比較和分析。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

巴馬小型豬20頭，普通級，雌雄各半,體重15～20 kg。實驗動物由東莞松山湖明珠實驗動物科技有限公司提供，生產許可證號：【SCXK(粵)2017-0030】。同時，實驗在該公司的普通級實驗設施內進行，使用許可證號：【SYXK(粵)2017-0123】。巴馬小型豬在同樣的環境下飼養，日常飼喂按日糧4%體重的標準提供，分別在每天8:00～9:00和16：00～17：00兩次飼喂，自由飲水。

1.2 主要試劑與儀器

豬胰島素ELISA試劑盒(CSB-E06828p)、豬胰高血糖素ELISA試劑盒(CSB-E04854p)、豬糖化血紅蛋白ELISA試劑盒(CSB-E17546p)，武漢華美生物工程有限公司產品。

血糖儀(強生 穩豪倍易型)，血糖試紙(強生 穩豪型)，低溫高速離心機(eppendorf 5810 R)，酶標儀(Thermo FC)，血液分析儀(sysmex XT-1800 i)，生化分析儀(OLYMPUS AU 2700)，臺式小型離心機(eppendorf 5418)，電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司 HWS 12型)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

選取高血糖家系的F5代巴馬小型豬10頭和普通正常的巴馬小型豬10頭，分別作為高血糖家系組和普通正常組，在6月齡時進行實驗。實驗動物于實驗前禁食16 h，實驗當天早上8點在空腹狀態下進行實驗。

1.3.2 空腹血糖和餐后2 h血糖檢測

通過前腔靜脈采集新鮮血液，使用血糖儀對新鮮靜脈血進行空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)測定。餐后2 h血糖(2 hour postprandial glucose，2 hPG)于進食第一口計時，于2小時后從前腔靜脈采集血液，用血糖儀進行測定。

1.3.3 靜脈葡萄糖耐量試驗(intravenous glucose tolerance test，IVGTT)

先對巴馬小型豬的體重進行稱量，再從耳緣靜脈注射50%的葡萄糖注射液，注射量為1.2 mL/kg，4 min內推注完[3]，在注射完葡萄糖后的第0、10、30、60和120分鐘從前腔靜脈采血，用血糖儀測量各時間點的血糖值。

1.3.4 糖代謝相關指標檢測

采集血液經離心處理后，用于檢測糖代謝相關指標。采用ELISA方法進行檢測，檢測如下指標：胰島素(insulin，INS)、胰高血糖素(glucagon，GC)、糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin，HbA1c)。

1.3.5 胰島素抵抗指數計算

根據空腹血糖和空腹胰島素計算胰島素抵抗指數：胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

1.3.6 血液生理生化指標檢測

EDTA-K2抗凝采血管采集的血液直接用于血液生理指標檢測，檢測指標如下：白細胞(white blood cell，WBC)、紅細胞(red blood cell，RBC)、血紅蛋白(hemoglobin，HGB)、紅細胞比容(hematocrit，HCT)、紅細胞平均體積(mean corpuscular volume，MCV)、紅細胞平均血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)、紅細胞平均血紅蛋白濃度(mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC)、血小板(platelets，PLT)、紅細胞分布寬度(red blood cell distribution width-standard deviation，RDW-SD)、紅細胞分布寬度(red blood cell distribution width-coefficient of variation，RDW-CV)、中性粒細胞(neutrophil，NEUT)、淋巴細胞(lymphocyte，LYMPH)、單核細胞(monocytes，MONO)、嗜酸性粒細胞(eosinophil，EO)、嗜堿性粒細胞(basophil，BASO)。普通采血管采集的血液分離的血清用于血液生化指標檢測，血液生化檢測指標如下：總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、球蛋白(globulin，GLO)、間接膽紅素(indirect bilirubin，IBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、膽固醇(cholesterol，CHOL)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-CH)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-CH)、甘油三酯(triglyceride，TG)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate transaminase，AST)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine transaminase，ALT)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 高血糖家系F5代系譜

經過長期的檢測，家系種公豬2907的空腹血糖維持在6.0 mmol/L以上，而同一環境下的普通正常巴馬小型豬的空腹血糖水平為2.0～3.5 mmol/L。應用此高血糖公豬組建家系，挑選空腹血糖在5.0 mmol/L的子代作為選育對象，現在已經選育到F5代(圖1)。從F 3代開始表現出遺傳性的高血糖，F5代的高血糖表現得更加顯著，F5代50%以上個體的空腹血糖穩定在6.0 mmol/L以上。

2.2 體重、空腹血糖、餐后2 h血糖和糖代謝相關指標結果

在體重、FPG、2 hPG和糖代謝相關指標的檢測中，高血糖家系組FPG、2 hPG、HbA1c和HOMA-IR的水平比正常組的顯著升高(P< 0.05)；兩組體重、INS和GC的水平差異無顯著性。(表1)

圖1 巴馬小型豬高血糖家系圖譜

表1 體重、空腹血糖、餐后2 h血糖和糖代謝相關指標結果(n=10)

Table 1 Results of body weight, FPG, 2 h PG, and glucose metabolism-related indexes

分組正常組高血糖家系組GroupsNormal groupHyperglycemia group體重body weight(kg)18.04±2.1818.52±1.04空腹血糖FPG(mmol/L)3.25±0.766.28±1.78**餐后2 h血糖2 hPG(mmol/L)3.40±0.616.66±1.72**胰島素INS(μIU/mL)16.54±2.6615.19±2.77胰高血糖素GC(pg/mL)284.95±30.18273.00±32.52糖化血紅蛋白HbA1c(ng/mL)248.01±40.12288.20±36.30*胰島素抵抗指數HOMA-IR2.42±0.844.15±1.19**

注：與正常組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。Note. Compared with the normal group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.3 靜脈葡萄糖耐量試驗結果

對兩組的個體進行靜脈葡萄糖耐量試驗，在注射完50%的葡萄糖注射液后，兩組的血糖水平都立即上升到28 mmol/L以上，之后血糖水平逐漸恢復，在60 min時基本恢復到空腹血糖水平。在60 min時，高血糖家系組的血糖水平下降到比空腹血糖還低的4.71 mmol/L，到120 min時恢復到5.97 mmol/L。高血糖家系組的FPG、30 min血糖水平和120 min血糖水平比正常組的顯著升高(P< 0.05)；兩組的0 min、10 min和60 min血糖水平差異無顯著性。(圖2)

2.4 血液生理檢測結果

在血液生理各項指標的檢測中，兩組的各項指標差異均無顯著性。(表2)

注：與正常組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。FPG表示空腹血糖水平。

表2 血液生理結果(n=10)

Table 2 Results of blood physiological indexes

分組正常組高血糖家系組GroupsNormal groupHyperglycemia group白細胞WBC(109/L)21.76±3.6022.23±7.51紅細胞RBC(1012/L)7.94±0.448.01±0.62血紅蛋白HGB(g/L)144.00±9.43144.10±13.06紅細胞比容HCT(%)45.20±2.9644.71±5.51紅細胞平均體積MCV(fL)57.00±3.0855.75±3.97紅細胞平均血紅蛋白量MCH(pg)18.16±0.9817.99±0.70紅細胞平均血紅蛋白濃度MCHC(g/L)318.55±5.37323.40±14.35血小板PLT(109/L)620.00±72.28615.90±134.20紅細胞分布寬度RDW-SD(fL)38.94±2.2740.60±3.68紅細胞分布寬度RDW-CV(%)21.95±1.4523.09±1.73中性粒細胞NEUT#(109/L)4.53±1.245.50±2.83淋巴細胞LYMPH#(109/L)14.99±2.9314.56±5.48單核細胞MONO#(109/L)1.41±0.321.29±0.31嗜酸性粒細胞EO#(109/L)0.61±0.350.65±0.46嗜堿性粒細胞BASO#(109/L)0.21±0.110.24±0.17中性粒細胞百分比NEUT%21.08±5.6924.56±10.71淋巴細胞百分比LYMPH%68.70±4.4365.44±9.23單核細胞百分比MONO%6.50±0.936.03±1.46嗜酸性粒細胞百分比EO%2.75±1.572.80±1.65嗜堿性粒細胞百分比BASO%0.96±0.481.17±0.97

2.5 血液生化檢測結果

在血液生化各項指標的檢測中，高血糖家系組膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的水平比正常組的顯著升高(P< 0.05)；兩組其余的血液生化指標差異均無顯著性。(表3)

3 討論

在相同的環境、飼喂和年齡等條件下，相比正常普通的巴馬小型豬，高血糖家系的F 5代個體在空腹血糖、餐后2 h血糖和糖化血紅蛋白的檢測結果上顯示出更高的血糖水平。高血糖是糖尿病最顯著的特征，現在臨床上主要用血糖水平來作為糖尿病的診斷指標。根據美國糖尿病學會的診斷標準，符合以下條件之一，則可以確診為糖尿?。?1)空腹血糖FPG ≥ 7.0 mmol/L；(2)口服葡萄糖耐量試驗2 hPG ≥ 11.1 mmol/L；(3)糖化血紅蛋白HbA1c ≥ 6.5%；(4)有典型糖尿病癥狀且任意時刻血糖PG ≥ 11.1 mmol/L(前三項需要復檢才能確診)。實驗小型豬的糖代謝、血液指標和糖耐量試驗反應過程與人類的十分相似，因此有學者指出小型豬糖尿病的判斷標準可以參照人類的糖尿病診斷標準[4]。亦有學者對一個巴馬小型豬群體進行測量和篩選，最后參照人類的糖尿病診斷標準，確立了巴馬小型豬的糖尿病標準：空腹血糖 > 6.9 mmol/L，靜脈給糖后2 h血糖 > 8.2 mmol/L[5]。在連續多次的檢測中，高血糖家系目前的F 5代個體中有4頭的空腹血糖水平保持在7.0 mmol/L左右的水平，而其中1頭的靜脈給糖后2 h血糖達到了8.9 mmol/L。

糖耐量可以衡量機體對血糖的調節能力，糖耐量一旦受損，很容易發展為糖尿病。臨床上通常采用口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)來對糖耐量進行評價，但實驗小型豬使用該方法操作較為不便而且容易造成誤差，所以本實驗采取靜脈葡萄糖耐量試驗(IVGTT)對小型豬的糖耐量進行評價。檢測結果顯示，高血糖家系組的糖耐量并未受損，對于血糖的變化有正常的調節能力。

在機體內，血糖的調節主要通過神經-體液調節，其中胰島素和胰高血糖素為主要的參與者。在患有糖尿病的情況下，血糖的調節出現異常，1型糖尿病主要因為胰島β細胞損傷從而胰島素分泌不足，而2型糖尿病則主要因為胰島素抵抗和胰島β細胞功能異常[6]?，F在有研究表明，2型糖尿病不僅存在胰島β細胞的異常，還會有胰島α細胞分泌的異常，胰高血糖素的異常分泌會促進高血糖和糖尿病的發生[7]。胰島素抵抗指數(HOMA-IR)由Matthews等提出[8]，可以用于胰島素抵抗的評估，計算公式為HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。在本實驗中，高血糖家系組的個體表現出了高血糖水平，但其胰島素和胰高血糖素的分泌并沒有出現異常，說明血糖異常的原因不是胰島素或者胰高血糖素的異常分泌。對于HOMA-IR的計算結果，高血糖家系組的HOMA-IR值明顯高于正常組的，說明高血糖家系組的個體存在著明顯的胰島素抵抗。當機體存在胰島素抵抗時，組織和細胞對胰島素的反應性和敏感性會降低，導致胰島素介導的葡萄糖攝取和利用效率下降，從而使機體保持高血糖水平。造成胰島素抵抗有多種原因和機制，例如肥胖、氧化應激反應、受體底物磷酸化作用、細胞器功能障礙等[9]，對于高血糖家系胰島素抵抗的成因尚未清楚，有待進一步的探究。

表3 血液生化結果(n=10)

注：與正常組比較，*P< 0.05。Note. Compared with the normal group,*P< 0.05.

糖尿病的發生經常伴有脂類的代謝異常，主要為CHOL、TG、HDL-CH和LDL-CH的代謝紊亂。多個臨床上的研究結果表明，糖尿病患者會伴隨TG、LDL-CH的增高和HDL-CH的降低[10-11]，因此可以通過血脂的監測對糖尿病進行早期預防。血脂異常的發生與胰島素抵抗有關，胰島素抵抗會影響機體內TG和HDL-CH的調控[12]。在本實驗的血液生化檢測結果中，高血糖家系組的TG和HDL-CH水平與正常組的差異不明顯，但其CHOL和LDL-CH都高于正常組的水平，與上述臨床研究中糖尿病患者的血脂檢測結果相一致，說明高血糖家系組存在一定程度的脂類代謝異常。

糖尿病不僅僅會伴隨血液生化指標的改變，還會對多項血液生理指標造成影響，如艾爾肯·塔西鐵木爾等[13]的研究中發現，糖尿病患者的單核細胞百分比、血紅蛋白、平均紅細胞體積、血小板平均分布寬度均明顯低于正常個體；李芳等[14]則發現糖尿病患者的血小板計數(PLT)低于健康人群，而血小板分布寬度(PDW)、血小板平均容積(MPV)和血小板比率(P-LCR)均高于健康人群。因此，可以通過血液生理指標的檢測來對糖尿病的發生進行監測，但本實驗中兩組血液生理的檢測結果差異不明顯。

綜上所述，本實驗對高血糖家系F5代個體的一系列指標進行檢測，檢測結果表明，該家系的F5代個體表現出高血糖和脂類代謝異常，其高血糖表現可能與胰島素抵抗有關。雖然有部分個體達到糖尿病的標準，但通過其他檢測指標的綜合評定，筆者認為這些個體尚未發展為糖尿病。目前，對該巴馬小型豬高血糖家系的選育策略為：進一步擴大種群，篩選性狀穩定的個體作為培育對象。筆者認為，通過進一步的繁殖和培育，該家系的個體有望成為研究糖尿病的動物模型。