幼羊顱骨缺損模型中顱骨組織Dlx2基因的表達及意義分析

畢玉杰，周 昊，崔 陽，邵 國，張春陽*

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，包頭 014010； 2.內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究中心，包頭 014040； 3.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)及分子生物學(xué)教研室，包頭 014040； 4.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院低氧適應(yīng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室，北京 100053)

各種原因造成的小兒外傷的發(fā)生率日益升高，在各類外傷中，顱腦外傷位居首位。顱骨作為腦組織的天然保護屏障，若其受到損傷，后果不堪設(shè)想。尤其對于小兒這一特殊群體，正處于生長發(fā)育的關(guān)鍵時期，若顱骨修補的選擇不當(dāng)，可能會對小兒的一生造成難以想象的后果[1]。截止目前，針對小兒顱骨缺損的修復(fù)問題，尚缺乏理想的修復(fù)方案，學(xué)者們紛紛從修復(fù)的必要性、時機、材料選擇等各個宏觀的角度進行了研究[2-3]，而利用組織病理學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息方法，從組織、細胞、分子和信號傳導(dǎo)途徑等層面，研究如何修復(fù)缺損區(qū)的顱骨組織可能還需進一步的補充。

DLx基因家族是同源盒基因系的一個分支，包括DLx2、DLx3、DLx5等，這些基因在頜面骨的發(fā)育中起重要作用[4-6]。剔除DLx2基因的新生小鼠出生后就死亡，并發(fā)現(xiàn)第一鰓弓衍化為畸形上頜突且(或)長骨發(fā)育異常[7-8]。DLx3誘導(dǎo)的成骨細胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)是通過p38/Smad5信號通路調(diào)控[6]。DLx5是BMP信號通路的靶基因，并且在骨形成和胚軸背腹側(cè)的形成中起重要調(diào)控作用[5]。這些結(jié)果提示DLx基因家族可能在顱面骨的發(fā)育和分化中起重要的調(diào)控作用。

Dlx2基因作為Dlx基因家族的一員，在調(diào)控細胞周期和凋亡、組織穩(wěn)態(tài)發(fā)展、器官形態(tài)發(fā)育等方面發(fā)揮著重要的作用[9-10]。小兒顱骨的生長方式屬于膜性成骨，成骨細胞的作用較活躍，能促進缺損邊緣處產(chǎn)生新的骨基質(zhì)，最后形成富有活力的骨組織[11]?；|(zhì)礦化是骨形成過程中的一個重要階段，也是一個緊密的有規(guī)律的過程，DLx2基因在參與調(diào)控成骨細胞的礦化過程中起重要作用[12]。目前關(guān)于Dlx2基因與骨代謝方面的研究多以鼠作為實驗動物，且大多局限于細胞層面，選擇與人類親緣更近的綿羊進行研究，探尋幼羊顱骨組織中Dlx2的表達情況，國內(nèi)外鮮有報道。本組實驗主要利用幼羊缺損模型，觀察顱骨缺損區(qū)域的新生骨組織中Dlx2的表達情況，從分子生物學(xué)的角度為小兒顱骨缺損的修復(fù)提供一定的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級雌性1月齡小尾寒羊10只，體重4.5～5.2 kg，來源于內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院動物實驗室[SCXK(蒙)K2016-0003]，無菌手術(shù)在內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實驗室[SYXK(蒙)K2005-0019]進行，動物實驗由內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動物實驗倫理審查委員會通過，倫理審批IACUC號：2016-033，實驗過程中按3R原則給予實驗動物人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol(美國Ambion公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工，B532445)；2XReal-time PCR Mix(南京博爾迪，BR101)；Dlx2基因和內(nèi)參β-actin基因的引物(南京金斯瑞)；兔源Dlx2抗體(英國Abcam公司，ab28461)；兔源Histone抗體(美國cell signaling公司，#4499)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗兔二抗(北京博奧森公司，bs-0295D)；ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒(北京普利萊公司，P1010)；槍頭與離心管(美國Axygen公司)。

自動雙重純水蒸餾儀(上海本波儀器有限公司，SZ-98)；立式壓力蒸汽滅菌器(日本坪山制作所株式會社，HVE/HVA)；干燥箱(上海善志，DHG-9023 A)；低溫高速離心機(德國eppendorf公司，Crntrifuge5424 R)；小型垂直電泳槽(美國BIO-RAD公司，1658001)；電泳儀電源(美國BIO-RAD公司，1645050)；凝膠成像系統(tǒng)(中國天能公司，1600)；普通PCR儀(美國MJ Research公司，26665)；超微量紫外分光光度計(美國Thermo公司，NanoDrop 2000)；ABI7900熒光定量PCR擴增儀(美國ABI公司，ABI7900HT FAST)；超聲波破碎儀(寧波科生超聲設(shè)備有限公司，JY98-Ⅲ)；常溫離心機(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司，D1009)；漩渦混合儀(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司，Mx-s)；全自動酶標(biāo)儀(美國Thermo公司，Multiskan FC)；搖床(美國Thermo公司)；Western blot 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(中國天能科技有限公司，Tanon4200SF)；微量移液器(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)；-80℃超低溫冰箱(美國Thermo公司)；-20℃冰箱和4℃冰箱(中國海爾公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 顱骨缺損模型的制作與取材

給予小尾寒羊3%戊巴比妥鈉溶液按照1 mL/kg體重，經(jīng)頸外靜脈注射麻醉后平臥于手術(shù)臺上，待麻醉滿意后進行手術(shù)。頭頂備皮，在手術(shù)室內(nèi)用2.5%的碘伏和75%的酒精常規(guī)消毒皮膚，鋪無菌手術(shù)洞巾，無菌條件下，由兩眼眶上緣連線中點至外耳道連線的中點線形切開頭頂部皮膚，切透骨膜并向兩側(cè)牽開，充分暴露顱骨(圖1)，用環(huán)形銑刀銑出直徑3 cm大小的顱骨缺損。雙氧水和慶大霉素鹽水反復(fù)沖洗手術(shù)區(qū)預(yù)防感染，將骨膜盡量平整的平鋪在顱骨缺損區(qū)上，取出牽開器，全層縫合頭皮。術(shù)后三天，每只羊給予青霉素320萬單位，分兩次肌肉注射。術(shù)后七天拆線。10只幼羊在相同飼養(yǎng)條件下，于1個月后宰殺，分別取缺損區(qū)新生的骨組織及其鄰近的原生骨組織置于事先做好標(biāo)記的凍存管中，儲存在-80℃的冰箱中備用。

1.3.2 Real-time PCR檢測顱骨組織Dlx2 mRNA的表達

1.3.3 Western blot檢測顱骨組織DLX2蛋白的表達

將-80℃冰箱取出的顱骨組織，液氮中凍存過夜，均加入RIPA強裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，用手持式勻漿器和超聲粉碎的方法，裂解10 min，將骨組織蛋白全部裂解，離心取上清，加入蛋白酶抑制劑(北京普利萊公司)。總蛋白經(jīng)BCA法定量，加入6xLoading Buffer上樣緩沖液和抗氧化劑，于100℃加熱5 min使蛋白變性，-20℃保存?zhèn)溆?。?0 μg總蛋白于8%SDS-PAGE膠中依次行電泳、轉(zhuǎn)膜、5%的脫脂牛奶封閉，1xTBST洗滌后PVDF膜上檢出目的蛋白和內(nèi)參蛋白的條帶，將膜剪開后，分別加入兔源Dlx2抗體(1∶800，英國Abcam公司)和兔源Histone抗體(1∶1000，美國cell signaling公司)，4℃孵育過夜。第2日吸棄一抗后，1xTBST洗滌3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗兔二抗(1∶1000，北京博奧森公司)孵育2 h，再次洗滌后，加入預(yù)先配置好的ECL發(fā)光液(A液∶B液=1∶1，北京普利萊公司)，于Western blot化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光、顯影。通過Image J軟件進行灰度值測量，以Histone為內(nèi)參，各條帶灰度值作為目的蛋白DLX2的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

圖1 切開后牽開暴露顱骨

2 結(jié)果

2.1 造模情況

造模完成后肉眼觀察小尾寒羊顱骨有一直徑3 cm左右的圓形骨缺損(圖2)，1個月后宰殺取材。

圖2 顱骨缺損模型

2.2 Dlx2在缺損區(qū)新生骨組織及鄰近的原生骨組織中mRNA的表達變化

通過對10對小尾寒羊顱骨缺損樣本進行Real-time PCR的檢測，比較了缺損區(qū)新生骨組織和鄰近的原生骨組織中Dlx2 mRNA的表達變化。缺損區(qū)新生骨組織中Dlx2基因的相對豐度值為(0.04051±0.005465)，鄰近的原生骨組織中Dlx2基因的相對豐度值為(0.02388±0.004418)，Dlx2在缺損區(qū)新生骨組織中的mRNA表達水平高于鄰近的原生骨組織(P< 0.05)，差異有顯著性。(圖3)

注：與原生骨組織組比較，*P < 0.05。

注：與原生骨組織比較，*P < 0.05。

2.3 DLX2在缺損區(qū)新生骨組織及鄰近的原生骨組織中蛋白的表達水平

通過對10對小尾寒羊顱骨缺損樣本進行Western blot的相對灰度值檢測，比較了缺損區(qū)新生骨組織和鄰近的原生骨組織中DLX2蛋白的表達變化。缺損區(qū)新生骨組織中Dlx2基因的相對灰度值為(6.308±0.8227)，鄰近的原生骨組織中Dlx2基因的相對灰度值為(2.328±0.4398)，DLX2在缺損區(qū)新生骨組織中的蛋白表達水平高于鄰近的原生骨組織(P< 0.05)，差異有顯著性。(圖4)

3 討論

顱骨作為腦組織最直接的保護屏障，若其缺損，對人的一生將會產(chǎn)生難以預(yù)測的影響[14]。顱骨缺損在小兒中的發(fā)生并不少見，據(jù)統(tǒng)計，跌倒墜落傷、交通事故傷在所有致傷因素中所占比例最高，依次為56%、29%，其次為碰撞傷(4%)、砸傷(1%)及其他原因不明因素傷(9%)[15]。盡管在小兒顱骨缺損方面的研究如火如荼，但大多局限于宏觀方面，由于其相比成人有一定的年齡特殊性，其按照成人修補方式進行修補的弊端也是顯而易見的，例如覆蓋式修復(fù)可能限制顱骨發(fā)育，非降解材料填充修復(fù)可能致骨窗邊緣和修復(fù)材料的對抗，均可導(dǎo)致顱骨發(fā)育畸形[16]，所以，小兒顱骨缺損修補給臨床醫(yī)生增加了難度。與其他部位骨質(zhì)缺損相似，若想進行顱骨缺損修復(fù)，也可利用一系列的分子機制進行調(diào)控等。

顱骨組織由細胞、纖維和基質(zhì)構(gòu)成，骨細胞是骨組織的主要細胞，而一個成骨細胞在3～4 d內(nèi)可分泌其三倍體積的基質(zhì)，然后自身埋于其中，即變?yōu)楣羌毎鸞17]，所以成骨細胞在骨組織的生長發(fā)育、骨量平衡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Dlx2調(diào)控生物體頭顱頜面部骨骼的發(fā)育[18-19]，在成骨細胞增殖、分化和成熟過程中起作用，可能直接參與骨細胞功能調(diào)控和骨形成過程[12]。有學(xué)者指出，Dlx2的表達可以誘發(fā)鈣黏蛋白和神經(jīng)細胞黏附因子的高表達，使神經(jīng)嵴細胞黏附性增加，出現(xiàn)細胞的聚集，促進骨的生成[20]。本實驗發(fā)現(xiàn)Dlx2在顱骨缺損區(qū)的新生骨組織中更高，與以上學(xué)者的研究結(jié)果一致。本實驗通過檢測顱骨缺損區(qū)的新生骨組織及其鄰近的原生骨組織中Dlx2的mRNA表達水平發(fā)現(xiàn)，在兩個區(qū)域中存在差異表達，與此同時，DLX2蛋白表達在顱骨缺損區(qū)的新生骨組織中表達增加。結(jié)果提示Dlx2表達增加與顱骨缺損區(qū)顱骨組織的新生可能密切相關(guān)。

從微觀分子方面入手，研究調(diào)控顱骨生長的相關(guān)因子及機制，利用分子生物學(xué)的方法探索小兒顱骨缺損修補的新手段，尚有很大的探尋空間[21]。據(jù)報道，DLx2應(yīng)該是成骨分化過程中一個關(guān)鍵分子[4,22-24]，在Dlx2mRNA的3’端中有一個假定的mir-539結(jié)合序列，Dlx2作為mir-539的一個目標(biāo)基因，mir-539可以通過靶向Dlx2參與成骨前細胞分化[20]。本研究結(jié)果提示，在新生的顱骨組織和其鄰近的原生骨組織中Dlx2表達存在差異，Dlx2的相對高表達主要表現(xiàn)在顱骨缺損區(qū)域新生骨組織的Dlx2 mRNA和DLX2蛋白等分子水平，在此過程中，Dlx2的骨基質(zhì)形成和成骨分化均有助于顱骨缺損區(qū)的組織生長，促進顱骨缺損的修復(fù)。因此，筆者猜測，可以將Dlx2作為調(diào)節(jié)顱骨缺損修復(fù)新的治療研究靶點。

本實驗研究結(jié)果顯示，顱骨缺損區(qū)新生的骨組織Dlx2的表達較其鄰近的原生骨組織高，筆者推測，Dlx2可能對顱骨缺損的修復(fù)起著重要作用[22-24]。在未來的研究中，Dlx2可能作為骨代謝和骨生長新的靶點，對其具體的調(diào)控通路和調(diào)控機制進行更深入的探索。由于本實驗只是檢測了10對小尾寒羊的顱骨組織標(biāo)本，樣本量相對有限；而且，本實驗采用小尾寒羊作為研究對象，與人類畢竟不是同一物種，可能存在物種差異性。只有將這些問題充分地解決好，才能真正有可能將這些科研成果應(yīng)用于臨床上小兒顱骨缺損的修補。