虎杖提取白藜蘆醇對PC-3細胞株的體外實驗研究＊

胡著云 ，戈陽華 ，周瓊 ，夏曙霞 ，徐慶剛 ，宮再興 ，殷雍

(1、江西中醫藥大學附屬醫院，南昌 330006；2、南昌市第三醫院，南昌 330009)

前列腺癌（PCa）的發病率位居所有男性惡性腫瘤的首位，且其死亡率位居男性惡性腫瘤的第2位，僅次于肺癌[1]。2015中國腫瘤登記年報顯示，2011年中國前列腺癌的發病率位居所有惡性腫瘤的第9位，城市人群中前列腺癌的發病率和死亡率，在所有男性惡性腫瘤中排名第6位和第9位[2]。

白藜蘆醇（3′，5′，4′-三羥基芪）是天然存在的多酚化合物，是中藥虎杖的主要活性成分之一，其可通過激活或抑制信號通路、調解基因表達、誘導細胞周期延遲、細胞凋亡等方式作用于癌細胞，從而發揮抗腫瘤作用[3]。本研究對虎杖提取白藜蘆醇誘導PC-3系細胞凋亡的作用及其機制進行研究，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料 Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，YP1002電子天平(上海越平科學儀器有限公司)，SQP型1/1萬電子天平 (賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)，L-550臺式低速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)。Leica DMIRB倒置相差顯微鏡 (OLYMPUS)，CO2培養箱（Sanyo，Japan），FAC Sort流式細胞儀(Becton Dickinson)，酶標儀，RPM I1640培養液(Gibcobrl公司)，PCR 提取及擴增試劑盒(Takara公司)。B iorad凝膠成像分析系統 (江蘇捷達公司)。F12培養基（HyClone Company），胎牛血清（HyClone Company），胰蛋白酶(Difco)，噻唑藍（Sigma），碘化丙啶(PI)，RNA 酶、TUNEL檢測試劑盒 (武漢博士德公司)，蛋白酶K(ProteinaseK)，二氨基聯苯(DAB)、多聚賴氨酸、二甲基亞砜DMSO （Sigma公司），白藜蘆醇對照品(11535-200502，供含量測定用，20mg，中國藥品生物制品檢定所)。

1.2 試驗藥物提取 本研究選用中藥虎杖產地為江西樟樹，經江西中醫藥大學中藥鑒定與炮制專家鑒定為廖科植物虎杖。采用醇提-樹脂分離工藝提取藥物中的白藜蘆醇成分，并采用萃取和硅膠柱層析相結合的方法，最終得到含90%白藜蘆醇的提取物[5]。

1.3 細胞培養 人前列腺癌PC-3細胞株購自中科院昆明細胞庫，將其置于含10%新生牛血清的RPMI1640培養液中，常規二氧化碳培養箱培養、傳代，直至細胞數量達到實驗要求。

1.4 四甲基噻唑藍（MTT）法檢測細胞抑制率 選取第14-16代PC-3細胞，配成5×104個/ml細胞密度接種于96孔培養板，于37℃、5%CO2，飽和濕度條件下培養 24h后， 分別用25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的白藜蘆醇干預 PC-3細胞 24、48和72h，同時設置對照組僅加入相應培養基。干預完成后，棄去培養基，加入200ml 5mg/m lMTT相同條件下繼續培養4h后終止。吸棄上清液加入50ml DMSO處理，采用酶標儀測定OD 450nm時各孔細胞吸光值（OD），實驗重復進行2次，然后計算抑制率。其中抑制率計算公式為（1-藥物干預組OD/對照組 OD）×100%。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 備好生長狀態良好的PC-3系細胞，其中生長范圍為80%-90%，采用0.05%胰蛋白酶將其消化成單細胞懸液，隨后培養于6cm皿中，密度為5×105個皿，時間為24h，此后分別加入濃度為 0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的白藜蘆醇，繼續培養24h后，充分稀釋、洗滌后取1×106/m l的細胞待檢測。將細胞重新懸浮，使其濃度為(2-5)×105/m l，加入 5μl Annexin V-FITC中。待3min后加入20μg/ml的碘化丙錠溶液 10μl，室溫孵育，避光 10min后加入 300μl緩沖液，采用流式細胞儀進行檢測和分析細胞凋亡情況。

1.6 Western blot法檢測Bcl-2和Survivin蛋白的表達 將 25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L 白藜蘆醇干預的PC-3細胞和對照組細胞進行裂解，BSA法檢測總蛋白量。蛋白制備樣本經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠100V恒壓電泳分離，然后按照凝膠面積以0.65mA/cm2恒流電轉移1.5h將蛋白自凝膠轉印至PVDF膜。PVDF膜經5%脫脂奶粉室溫封閉2h后，加入1∶1000稀釋的一抗，4℃孵育過夜，封閉液漂洗后加入1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG二抗，室溫孵育1.5h，漂洗后用ECL化學發光試劑盒增強發光，X線膠片顯影。

1.7 統計學分析 采用SPSS 17.0軟件分析數據。計數資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，以均數±標準差（x±s）表示。 P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1 不同濃度白藜蘆醇對PC-3細胞抑制率比較隨著白藜蘆醇濃度的增高，PC-3細胞抑制率明顯增加，各組間比較差異顯著（P＜0.05）；同時隨著時間的延長，PC-3細胞抑制率也明顯增加，差異顯著（P＜0.05）。 見表 1。

表1 不同濃度白藜蘆醇對PC-3細胞抑制率比較（x±s，%）

2.2 不同濃度白藜蘆醇對PC-3細胞凋亡的影響隨著白藜蘆醇濃度的增加，PC-3細胞凋亡率明顯升高，具有明顯的劑量依賴關系，呈劑量—效應關系(P＜0.05)。 見圖 1。

2.3 不同濃度白藜蘆醇對PC-3細胞中Bcl-2和Survivin蛋白表達的影響 隨著白藜蘆醇濃度的增加，PC-3細胞中Bcl-2和Survivin蛋白的平均光密度均明顯下降，各組間比較差異顯著（P＜0.05）。見表2。

圖1 不同濃度白藜蘆醇對PC-3細胞凋亡的影響

表2 各濃度白藜蘆醇對PC-3細胞中Bcl-2和Survivin蛋白表達的影響（x±s）

3 討論

腫瘤的發生、發展與細胞凋亡關系密切，其中凋亡抑制蛋白在前列腺癌的發生中起著極為重要的作用[5]。Bcl-2蛋白是細胞凋亡的關鍵調控者，同時也是第一個確認能對抗細胞凋亡的基因，其主要是通過線粒體外膜達到調節細胞凋亡的作用。相關研究顯示，Bcl-2蛋白不僅與前列腺癌的發生有關，還與前列腺癌的臨床病理特征有關。且Bcl-2蛋白的過表達促進了前列腺癌的發生和發展[6]。Survivin蛋白被證實是作用最強的凋亡抑制因子，其可參與細胞增殖分裂、細胞周期以及細胞凋亡的調控過程，具有調節細胞分裂和抑制細胞凋亡的雙重功能，其在癌細胞中過度表達可能是腫瘤預后不良的一個因素[4]。且國外研究顯示，前列腺癌中Survivin蛋白的表達與腫瘤的分期、分級密切相關，Survivin蛋白過表達會導致細胞加快向S期轉換，抵抗G期抑制，從而促進細胞增殖[6]。同時，Survivin的組織分布有明顯的選擇性，其在正常成人組織中不表達，但在前列腺癌組織中呈現出高表達狀態[6]。

基于此理論，針對凋亡抑制蛋白進行基因治療可以促進前列腺腫瘤細胞凋亡并抑制其增殖，同時又不影響正常組織，具有良好的靶向性、特異性和安全性[7]。為此尋找能有效干預細胞凋亡抑制蛋白的新型藥物成為前列腺癌研究的關鍵。白藜蘆醇屬于非黃酮多酚類化合物，是中藥虎杖的主要活性成分之一。藥理學研究表明，其具有良好的抗腫瘤作用，抑制腫瘤轉移、逆轉腫瘤耐藥、增強化療藥物藥效、減少化療不良反應等作用[8]。本研究將不同濃度的虎杖白藜蘆醇對PC-3細胞進行體外實驗，結果顯示，PC-3細胞的增殖抑制、凋亡發生顯著改變，說明白藜蘆醇對前列腺癌細胞的增殖、凋亡可能具有調節作用。隨著濃度的增加，白藜蘆醇對前列腺癌PC-3細胞的抑制率逐漸增加，且呈現出時間-劑量依賴性，細胞的形態及增值情況差別顯著。此外，隨著白藜蘆醇濃度的增加，PC-3細胞凋亡率明顯升高，具有明顯的劑量依賴關系。虎杖白藜蘆醇有有效促進PC-3細胞凋亡，而通過Western blot提示，白藜蘆醇能夠抑制前列腺癌細胞Bcl-2和Survivin蛋白的表達，通過降低Bcl-2和Survivin蛋白的表達Bcl-2和Survivin蛋白的表達，從而促進細胞凋亡。因而本研究認白藜蘆醇能夠抑制前列腺癌細胞生長，其機制可能與白藜蘆醇通過抑制Bcl-2和Survivin蛋白的表達而阻斷信號通路有關。白藜蘆醇抑制前列腺癌的具體作用機制仍需進行深入探討，并需進行前列腺癌動物模型結合體內實驗進行深入探討，且白藜蘆醇廣泛存在于中草藥及其他植物中，應提取不同植物的白藜蘆醇進行實驗研究，以便為將白藜蘆醇作為預防或治療前列腺癌的有效藥物提供實驗基礎和最為充分的實驗依據。