甲型H1N1流感病毒RNA定量分析在輕型與肺炎患者中的應用

吉茂禮,程 濤

1.陜西省商洛市中心醫院檢驗科(商洛726000)，2. 陜西省咸陽市涇陽縣醫院檢驗科(涇陽713700)

主題詞 流感病毒A型, H1N1亞型 逆轉錄聚合酶鏈反應 診斷 預測

甲型 H1N1流感是由甲型 H1N1流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，最初在墨西哥發現。人群對甲型H1N1流感病毒普遍易感。H1N1病毒毒株包含豬流感、禽流感和人流感三種基因片段。這種病毒可以在人群中互相傳染。人感染甲型 H1N1流感后的早期癥狀與普通流感相似,患者會出現發熱、咳嗽、喉痛、身體疼痛、頭痛、發冷和疲勞等,有些還會出現腹瀉或嘔吐、肌肉痛或疲倦、眼睛發紅等[1]。感染甲型H1N1的患者中有相當一部分病例病情重，進展迅速，可發展為肺炎、呼吸衰竭、多臟器功能障礙，更為嚴重者可以導致臨床死亡[2]。因此，甲型流感的早期診斷可為其合理預防、合理救治、提高生存率、降低病死率奠定基礎。本研究采用實時逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術檢測甲型流感患者咽拭子中H1N1流感病毒的基因表達，進而為H1N1亞型的早期診斷和治療提供基因依據。

對象與方法

1 研究對象 收集2016年2月至2017年2月期間于兩院發熱門診就診的70例甲型流感H1N1亞型患者及30例普通甲流(普通組)的咽拭子標本，其中女19例，男51例，年齡0～75歲。依據H1N1亞型患者病情狀況分為輕型甲流(輕型組)和肺炎甲流(肺炎組)。其中輕型53例，肺炎17 例。甲流感染患者體溫在38℃以上，伴有頭痛、咳嗽、喉痛、全身酸痛、乏力等上呼吸道感染癥狀。1例肺炎H1N1亞型甲流感染患者由于呼吸衰竭，搶救無效死亡，其余病例經治療后痊愈。甲流感染患者經 PCR 核酸檢測確診, H1N1亞型診斷標準符合衛生部甲型H1N1流感診療方案[3-4]。甲型H1N1亞型患者分類標準：胸部 X線檢查有片狀陰影；胸部CT 檢查有片狀陰影。當出現以上情況之一時判斷為肺炎病例，否則判斷為輕型病例[2]。本研究得到本院醫學倫理委員會的同意以及所有參與者的知情同意。

2 研究方法 ①對所有甲型流感患者的病例建立數據庫，登記年齡、性別、臨床表現、血常規、胸部 X 線片和胸部 CT。以第一次檢查結果為基線資料。②標本采集：采集甲流感染患者咽拭子標本，標本采集后置于密封的帶螺旋蓋的塑料管內，塑料袋密封，24 h內冷藏運輸至咸陽市疾病預防控制中心實驗室，采用RT-PCR方法確診。血常規采用日本西森美康SESMESE-2000 全自動血常規分析儀檢測。③甲型流感普通型病毒和甲型H1N1病毒亞型檢測：采用Trizol法提取咽拭子中的總RNA，采用RT-PCR技術研究甲型流感患者普通型病毒和甲型H1N1病毒的表達。利用GenBank的信息，根據流感病毒基因數據庫，分別選擇甲型HlNl流感病毒HA基因和甲型普通流感病毒M基因的核苷酸保守序列(CY083926和CY037368，片段長度分別為152和128 bp)。采用Primer ExPress 2.0軟件設計引物，采用β-actin 作為內對照。上游引物(F)和下游引物(R)如下：甲型HlNl亞型流感病毒，F1：5'-TGCTATAAACACCAGccTCCC-3’，R1：5’-GCAATGG CCCCAAATAGG-3’；甲型流感病毒，F2：5’-TTCTAACCGAGGGTCGAAACGT-3’，R2：5’-CCA TCCATGAGAGCCTCAAG-3’；β-actin的引物序列為F3：5’-AGGCACTGGGGCTTCATCTGAC-3’，R3： 5’-GCCTTCCATCCCTTTGCTTAG-3’。按操作說明書進行RT-PCR。PCR反應體系如下：10 μl 2×Taqman通用的PCR預混物，1 μl 20×miRNA特異性引物，1.33 μl cDNA，7.67μl水；反應條件：95℃變性10 min，95℃、1 5s，60℃、1 min，50個循環，置于4℃ 結束反應。使用熒光定量 PCR儀ABI7500 進行 PCR 擴增。④標準曲線的建立和敏感度測定：分別將甲型HlNl流感和甲型流感外轉錄的標準品按10倍梯度稀釋成108～101拷貝/μl，依次對上述各定量樣品進行檢測，建立標準曲線，測定敏感度。⑤臨床樣品檢測：用建立的熒光定量RT-PCR方法對疑似甲型流感患者的咽拭子樣本進行檢測，并采用上海科華生物工程股份有限公司生產的甲型普通型和甲型H1N1流感病毒(2009)RNA檢測試劑盒(熒光PCR法)同步檢測，對陽性樣品進行測序驗證。⑥測序驗證：提取流感病毒基因組RNA作模板，經逆轉錄后，進行正反向測序，與美國國立生物信息中心(NCBI)進行比對驗證。

結 果

1 基線資料 0～18歲年齡段輕型患者多于肺炎，而46歲以上年齡段肺炎患者較多(P<0.01)，見表1。輕型組和肺炎組性別比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。肺炎組白細胞總數(WBC)與輕型組比較顯著降低，而中性粒細胞分類計數(NEUT)則顯著增高，差異均有統計學意義(P<0.01)，輕型組與普通組比較，差異無統計學意義(P<0.05)，見表3。

表1 輕型和肺炎患者在各年齡段分布對比[例(%)]

注：與輕型組比較,*P<0.01

表2 輕型和肺炎患者性別結構對比[例(%)]

注：與輕型組比較，*P>0.05

表3 各組白細胞總數和白細胞分類結果比較

注：與輕型組比較,*P<0.01

2 各組咽拭子甲流病毒檢測結果比較 肺炎組病毒水平與輕型組以及普通組比較顯著上調，其差異均有統計學意義(P<0.01)，見表4。

表4 各組咽拭子甲型流感H1N1型 和普通型病毒RNA水平比較

注：與輕型組比較，*P<0.01;與肺炎組比較，#P<0.01

3 相關性分析 在甲型H1N1亞型肺炎組中，H1N1病毒表達水平與白細胞總數具有負相關性，而與中性粒細胞分類具有正相關性(r=-0.933，0.912，P<0.01)，見圖1、2。

圖1 H1N1RNA水平與WBC相關性

圖2 H1N1RNA水平與NEUT相關性

4 ROC曲線分析 以肺炎組和輕型組為因變量分析顯示，咽拭子中甲型H1N1流感患者病毒RNA的AUC為0.840(95%CI：0.674～0.903，P<0.01)。在最佳臨界值處的敏感性和特異性分別為93.2%和77.7%。以上顯示咽拭子中H1N1病毒水平在甲型流感病情診斷中有臨床意義，見圖3。

圖3 H1N1在診斷甲型流感中的ROC曲線

H1N1是一種新型流感病毒,可感染人類、禽類、家畜。主要包括人流感、禽流感和豬流感三種流感病毒的核糖核酸和基因片段，同時有非洲豬流感和亞洲豬流感病毒的特征[5]。2009 年 6 月 11 日，WHO 宣布甲型H1N1流感大流行警告級別升至第六級[6]。甲型H1N1 流感患者的初始癥狀與一般病毒性呼吸道感染相似,流涕、鼻塞、發熱、頭痛、軀體疼痛,部分患者病情進展迅速,體溫大于39℃,可發展為重癥肺炎，最終發展為呼吸衰竭、多臟器功能障礙，甚至可導致死亡[7]。熒光定量 PCR 方法已廣泛應用于基因表達、病原體檢測等諸多研究領域[1]。熒光定量RT-PCR技術在鑒別甲型H1Nl流感、甲型流感中已經被廣泛應用，其檢測靈敏度達102拷貝/μl,3次重復性試驗的相對標準偏差均小于1%，具有很好的靈敏度、重復性以及很強的特異性[8]。張興權等[9]應用RT-PCR技術研究阿比朵爾體外對2009甲型流感病毒 (H1N1)復制的影響。他們的實驗結果顯示，當藥物濃度為25、12.5、6.25 μmol/L時，H1N1病毒考貝數分別為(2.56±0.83)、(2.33±0.43)、(2.08±0.48)，而對照組H1N1病毒考貝數為(4.66±0.59)。提示阿比朵爾明顯抑制2009新型流感病毒A(H1N1)的復制。以上研究顯示RT-PCR技術定量地分析H1N1的RNA病毒表達水平的變化。在隨后的報道中進一步印證了RT-PCR技術應用于H1N1甲型流感診斷中的作用。這項實驗的RT-PCR病毒定量檢測結果顯示,過表達Cirp能顯著促進H1N1甲型流感病毒的增殖,Cirp+BHK-21細胞在感染H1N1病毒3、9、15、21 h后細胞中的病毒拷貝數分別為對照組的111%、103%、167%和235%，其差異有統計學意義[10]。我們的研究應用RT-PCR技術定量分析了感染H1N1流感病毒初期以及發展為肺炎患者的咽拭子中的病毒表達水平,結果顯示肺炎組H1N1病毒HA基因與輕型組以及普通組比較均顯著上調(P<0.01),提示隨著甲型流感病情的不斷進展病毒水平進一步增加。因此,分析甲型流感H1N1病毒RNA表達水平可以判斷該疾病的狀況,預測H1N1患者病情的進展并且為其治療提供依據。

研究認為,甲型H1N1流感患者在疾病初期白細胞總數以正常為主。但當病情嚴重時，肺炎白細胞降低人數顯著超過輕型組，而中性粒細胞分類比率明顯高于輕型組。以上提示白細胞總數降低和中性粒細胞百分比升高能反映甲型H1N1流感患者病情狀況[2]。王威等[11]分析甲型H1N1流感病毒合并重癥肺炎患者的血常規結果發現，外周血白細胞多表現為不高或降低，白細胞分類可見淋巴細胞或單核細胞增高，亦有病例表現為中性粒細胞增高為主。我們的研究結果與上述文獻報道基本相符。進一步的研究顯示年輕患者癥狀較輕,年齡大(≥46歲)的患者癥狀較重。本文的相關性分析顯示,甲型H1N1流感患者病毒RNA表達量與外周血白細胞總數具有負相關性,而與中性粒細胞比率具有正相關性。ROC曲線的分析結果提示H1N1流感患者病毒RNA水平對于甲型流感病情的診斷有較高的靈敏度、特異度和曲線下面積。因此認為，H1N1病毒RNA表達更有效地反映了甲型H1N1流感的病程進展,檢測其水平可用于H1N1的早期診斷及病情預測。