白羊草Epichlo?屬內生真菌的分離鑒定及其重金屬耐受性

賈 彤,王瑞宏,曹苗文

山西大學黃土高原研究所,太原 030006

內生真菌(endophyte)為“生活在活體植物地上部分的組織中,而不引起宿主植物明顯病害癥狀的真菌”[1]。草本、灌木、針葉樹和藻類等都可成為內生真菌的宿主,其中最常見的宿主是禾本科植物。在溫帶天然禾草中,約十分之一植物感染內生真菌[2],早熟禾亞科約有30%植物感染內生真菌[3-4]。Epichlo?屬內生真菌與冷季型禾草共生,全世界至少有30個屬的禾草感染這種內生真菌,也是目前研究最為廣泛的內生真菌之一[5-6],已命名的與天然禾草共生的Epichlo?屬內生真菌共有43種[7]。例如,王志偉等從華東、華北以及西北等地區的鵝觀草屬(Roegneria)植物中發現Epichlo?yangzii[8]和Epichlo?sinicum[9]兩種不同的特異性內生真菌。李春杰等從醉馬草(Achnatheruminebrians)中得到Epichlo?gansuensis[10]。羽茅(Achnatherumsibiricum)在自然種群中感染的兩種優勢菌株為Epichlo?gansuensis和Epichlo?sibirica[11]。朱敏杰等[12]從羊草(Leymuschinensis)中分離得到Epichlo?bromicola內生真菌。此前,本課題組已對天然禾草白羊草(Bothriochloaischaemum)中內生真菌的分布調查發現,白羊草中感染的16種內生真菌分別為赤霉屬(Gibberella)、鐮刀菌屬(Fusarium)、青霉屬(Penicillium)[13],但對白羊草中Epichlo?屬內生真菌的研究還未見報道。

關于內生真菌提高栽培禾草的抗生物與非生物脅迫的研究較多,但關于尾礦區內生真菌感染對天然禾草的重金屬抗性研究還相對較少。微量金屬離子可滿足微生物正常生長,過量則會產生毒害作用。高重金屬環境中,有些微生物對多種重金屬具有抗性,這些微生物在重金屬污染的生物修復過程中發揮重要作用。大多數抗重金屬微生物的研究集中于根際和非根際土壤微生物,對植物內生真菌重金屬抗性的研究報道較少。有研究發現,紫霉屬(Purpureocillium)內生真菌可以在銅脅迫條件下促進秋茄紅樹林生長[14]。Zhang等[15]研究3種深色有隔內生真菌(H93、H125 和 H114)都對Pb和Cd具有耐受性?？涤畹劝l現接種深色有隔內生真菌能改善重金屬 Cd 脅迫下紫莖澤蘭的生長狀態[16],并且深色有隔內生真菌通過調節植物激素平衡以及光合作用強度使玉米中Cd含量降低,進而促進玉米生長[2,17-18]。相對于菌根真菌,內生真菌存在于植物的地上部分,同時內生真菌感染對宿主植物的生長具有促進作用[16],染菌植物可能借助于菌絲本身對重金屬的積累,使宿主具有較高生物量且根系活動加強,進而在修復重金屬污染土壤中發揮作用。內生真菌宿主范圍較廣且可分離培養,例如青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)以及鐮刀菌(Fusarium)等都是植物體內常見的內生菌。Epichlo?屬內生真菌也能夠提高寄主禾草對Al[19]、Zn[20]和Cu[21]的耐受性。內生真菌還可以影響宿主禾草對Fe、Zn、Cu、Ca和P等礦質元素的吸收和運輸[19,22]。李川等研究發現,感染內生真菌可以提高宿主植物羽茅和高羊茅(Festucaarundinacea)對重金屬鋅的耐受性[18,23]。醉馬草感染的Epichlo?gansuensis內生真菌可提高宿主的抗旱性、耐鹽性[24]、和對重金屬脅迫的耐受性[25-26]。

白羊草為禾本科孔穎草屬多年生牧草,屬于喜溫性中旱生植物[27],屬于根莖疏叢型下繁禾草,具有短根莖、根系發達、分蘗能力強、能形成大量基生葉叢的特點[28]。葉片無毛或少毛,莖頂著生有4～多數總狀花序,穎果,具有有性及無性繁殖能力,壽命長達10年以上。適口性強,是一種優良水土保持型的牧草資源。白羊草群落是我國暖溫帶森林草原區有代表性的植被類型,也是落葉闊葉林區森林破壞后出現的次生植被類型[29],白羊草廣泛分布于黃土高原東南部和南部的低山丘陵、梁峁頂部的溫暖帶地段[30]。本實驗通過形態學描述和分子鑒定的方法,對銅尾礦庫白羊草內生真菌進行分離和鑒定,探究與白羊草共生的Epichlo?屬內生真菌特點,并通過對內生真菌進行不同重金屬脅迫處理,探究與白羊草共生的Epichlo?屬內生真菌重金屬耐受性潛力,這為豐富禾草內生真菌資源,以及內生真菌資源在重金屬污染土壤修復中發揮作用提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

本研究試驗樣地位于山西省垣曲縣,該地年均氣溫13.5℃,年均降水量631 mm。北方銅業銅礦峪礦十八河尾礦壩,溝口筑壩,壩體呈梯形。始建于1969年,初期壩高23.0 m,壩頂高程509.0 m?，F已筑 14級子壩,壩頂高程564.2—570.8 m,平均壩高43.0 m,壩頂長度1714.8 m[31]。尾礦庫壩體為人工堆積,將庫區近壩體礦砂推至壩前,通過碾壓處理將其壓實形成壩體,其成分主要為尾礦土、尾礦砂和人工覆蓋的黃土。各個子壩植物群落以白羊草為優勢種。2015年7月,自上而下共設置9個不同恢復年限的樣地,在每個樣地采集白羊草30株。將白羊草帶回實驗室進行內生真菌的分離與鑒定,研究結果發現,不同子壩白羊草內生真菌為赤霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬(Penicillium)[13]以及Epichlo?屬。通過用強氧化物對白羊草地上部分進行消解,再將消解產物用等離子體發射光譜儀(iCAP 6000, Thermo Fisher, UK)測定其重金屬含量[32]。重金屬進行檢測,結果發現As含量為0.46 mg/L,Cd含量為3.07 mg/L,Cr含量為658.55 mg/L,Cu含量為153.29 mg/L,Pb含量為194.82 mg/L,Zn含量為62.35 mg/L。

1.2 內生真菌分離及孢子觀察

首先進行植物表面滅菌,將白羊草葉鞘剪成約1 cm的小段,放入70%的酒精中5 s,再用5%的次氯酸鈉浸泡7 min,在浸泡過程中不斷搖晃,倒掉次氯酸鈉加入無菌水,用無菌水清洗至少3次,每次30 s。將表面滅菌后的莖段橫放或插入配制好的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(Potato Dextrose Agar,PDA)中,置于25℃培養[12]。待真菌從培養基上長出來后,對單一菌落進行純化,純化4代后,菌落形態保持世代不變后進行孢子形態觀察。將無菌水滴在載玻片上,挑取菌絲置于載玻片上,蓋上蓋玻片用數碼成像顯微系統(Moticam Pro 205A,Motic,Germany)觀察[9]。

1.3 內生真菌的分子鑒定

內生真菌DNA提取[8]：提出來的DNA用多功能酶標儀(Infinite M200Pro NanoQuant,TECAN,Austria)測定其濃度和純度,并用1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察提取結果[13]。PCR反應：將提出來的DNA稀釋至10 ng/μL,選用引物見表1[5]。act反應體系50 μL,含有：Template 10 μL,act-F、act-R 各1.0 μL(10μmol/L)(上海生工),10×EasyTaqBuffer 5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL,EasyTaqDNAPolymerase 0.5 μL,ddH2O 30 μL。根據曹苗文等所設置的條件進行調整[13],下同,反應條件為：94℃,9 min;94℃,1 min;52℃,1 min;72℃,2 min;72℃,5 min,共40個循環;Tub反應體系50 μL,含有：Template 10 μL,Tub-F、Tub-R 各0.8 μL(10 μmol/L)(上海生工),10×EasyTaqBuffer 5μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL,EasyTaqDNAPolymerase 0.5 μL,ddH2O 30.4 μL。反應條件：94℃,9 min;94℃,1 min;54℃,1 min;72℃,2 min;72℃,5 min,共40個循環;tef反應體系50 μL,含有：Template 10 μL,tef-F、tef-R 各1.0 μL(10 μmol/L)(上海生工),10×EasyTaqBuffer 5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL,EasyTaqDNAPolymerase 0.5 μL,ddH2O 30 μL。反應條件：94℃,9 min;94℃,1 min;60℃,1 min;72℃,2 min;72℃,5 min,共40個循環[7- 8]。經瓊脂糖凝膠電泳確定PCR結果,選擇最佳PCR產物送至華大基因有限公司測序。

表1 用于tubB、tefA 和actG PCR 擴增的引物

1.4 重金屬脅迫處理

向YM液體培養基(每1 L蒸餾水中有麥芽糖3 g,酵母粉3 g,蛋白胨5 g和葡萄糖10 g)中加入不同濃度的重金屬溶液,基于前期對銅尾礦壩土壤及白羊草葉片和根重金屬的背景調查,分別利用ZnSO4,CuSO4,PbSO4,CdCl2母液設置重金屬脅迫梯度為Zn2+(0、20、40、60、80、120 mg/L),Cu2+(0、20、40、80、120、160 mg/L),Pb2+(0、60、120、180、240、300 mg/L),Cd2+(0、2、4、6、8 mg/L),每個濃度設置3個重復。無菌條件下,從活化后的內生真菌液體培養基上吸取350 μL菌懸液于YM培養基中,將其放置到恒溫培養振蕩器(ZWY- 200D)中培養(200 rpm,25℃),根據白羊草內生真菌生長曲線的結果,本實驗將內生真菌生長的測定時間確定為15天。培養結束后,用滅菌濾紙過濾收集內生真菌,放入烘箱65℃烘干稱重,計算菌絲生長量。菌絲體干重的計算：過濾菌液前將濾紙標號并稱重,在烘箱中至恒重后用電子天平稱濾紙干重,烘干后濾紙的干重與過濾前濾紙差值即為菌絲體干重。

1.5 分子系統學分析

對于序列數據,首先把測序結果前端和后端的雜峰序列去除,然后在National Center for Biotechnology Information(NCBI)數據庫進行BLAST比對。先使用MEGA6校準,然后去除比對序列兩端多余的部分,使序列等長,然后運用最大似然法(Maximum-Likelihood法)進行系統發育分析,制作系統進化樹,同時計算遺傳距離。

1.6 統計分析

不同重金屬脅迫下內生真菌生長量的均值比較采用SPSS 19.0進行單因素方差(One-way ANOVA)分析,并進行Duncan顯著性檢驗,結果采用SigmaPlot 12.5進行作圖。

2 結果與分析

2.1 白羊草內生真菌形態學特征

菌落在25℃、PDA培養基上生長4周的直徑為23.2—39.1 mm。菌落白色、棉質、緊實、在培養基表面突出、無回旋或呈輕微回旋狀;氣生菌絲透明、豐富、光滑;菌落背面淺黃色。培養條件下孢子豐富,產孢細胞在氣生菌絲上側向生長,分生孢子透明,橢圓形或腎形,大小為1.2—8.0 μm(圖1,表2)。

圖1 白羊草中Epichlo? sibiria的菌落(a)和分生孢子形態(b,c)Fig.1 Colony(a) and conidia(b,c) of Epichlo? sp. isolated from B. ischaemum照片拍攝于菌株(Epichlo? sp.)在PDA培養基上黑暗培養3周后。左：標尺= 1 mm;中：標尺=10 為μm

編號Number孢子大小/μmSpore size生長速率Growth rate/(mm/周)編號Number孢子大小/μmSpore size生長速率Growth rate/(mm/周)Epichlo? sp.01(1.208—3.642) × (1.703—3.642)8.248±1.011Epichlo? sp.05(2.036—3.115) × (2.036—5.260)9.788±2.432Epichlo? sp.02(3.025—3.025) × (3.025—5.122)6.239±0.164Epichlo? sp.06(2.067—4.931) × (2.067—7.718)8.248±1.835Epichlo? sp.03(1.876—2.626) × (1.876—5.281)7.180±0.204Epichlo? sp.07(1.360—3.054) × (1.360—6.773)6.332±0.166Epichlo? sp.04(1.997—4.188) × (1.997—8.048)5.810±0.120

2.2 白羊草內生真菌部分Epichlo? sp.菌株tubB、tefA 和actG 擴增結果

用Moon 等[23,25]設計的引物(表1),分別對白羊草內生真菌actG、tefA和tubB進行擴增,結果顯示：3 對引物在所有菌株的actG、tefA和tubB擴增中,都得到了清晰的片段,大小分別為1600 bp, 800 bp和940 bp左右(圖2)。

圖2 部分白羊草內生真菌actG、tefA 和tubB擴增結果 Fig.2 Some PCR products of actG, tefA and tubB from endophytes associated with B. ischaemum

2.3 白羊草內生真菌系統發育分析

從不同白羊草葉鞘中分離得到的內生真菌在菌落形態和生長速度上都具有典型的Epichlo?屬內生真菌的特征 (圖1)。將白羊草葉鞘分離出的內生真菌對actG,tubB和tefA 片段進行PCR擴增并測序,將測序結果在NCBI數據庫進行BLAST比對,結果發現,這些內生真菌與Epichlo?屬菌相似性達到97%以上。將這些菌株序列與白羊草內生真菌進行系統發育分析。從actG系統發育樹可以看出,白羊草內生真菌與羽茅和醉馬草中的E.gansuensis和羽茅中的E.sibirica相似可能性較大(圖3);從tefA系統發育樹結果可知,白羊草內生真菌與E.sinicum系統發育距離最近,其次為E.chisosum,而與E.gansuensis和E.bromicola形成了一個亞枝(圖4)。tubB的系統發育樹結果顯示,白羊草內生真菌首先與鵝觀草屬植物中E.sinicum聚合在一起,然后與來自日本兩種冰草屬(Agropyronciliare和Agropyrontsukushiense)菌株形成一亞枝(圖5)。

圖3 根據actG序列,使用最大似然法(ML)構建系統發育樹Fig.3 Phylogeny derived from the maximum likelihood (ML) analysis of actG sequences進化枝上顯示的數字(≥50%)表示1000 次自展檢驗后的置信度

圖4 根據tefA序列,使用最大似然法(ML)構建系統發育樹Fig.4 Phylogeny derived from the maximum likelihood (ML) analysis of tefA sequences進化枝上顯示的數字(≥50%)表示1000 次自展檢驗后的置信度

圖5 根據tubB序列,使用最大似然法(ML)構建系統發育樹Fig.5 Phylogeny derived from the maximum likelihood (ML) analysis of tubB sequences進化枝上顯示的數字(≥50%)表示1000 次自展檢驗后的置信度

2.4 白羊草內生真菌對重金屬的耐受性

由圖可知,隨著Zn2+濃度的增加,內生真菌干重呈現先下降后上升的趨勢,在Zn2+濃度為20 mg/L是內生真菌干重達到最低值為0.12 g,在濃度為80 mg/L,干重達到最大值為0.28 g(圖6)。隨著Cu2+濃度升高,內生真菌干重呈現先升高后下降的趨勢,Cu2+濃度為40 mg/L時,內生真菌干重達到最大,且顯著高于對照組。濃度從40 mg/L到120 mg/L時菌絲干重緩慢降低(圖6)。Epichlo?屬內生真菌對Pb2+脅迫的響應表現為,當Pb2+為240 mg/L,菌絲干重達到最大值,并且顯著高于其他各濃度下菌絲重量(圖6)。對于Cd2+脅迫而言,各個梯度下內生真菌干重均無顯著差異(圖6)。

圖6 不同重金屬脅迫下白羊草內生真菌的菌絲干重Fig.6 The dry weight of Bothriochloa ischaemum endophytes under different heavy metal stresses

3 討論

本研究首次從白羊草中檢測并分離得到Epichlo?屬內生真菌。tubB和tefA序列系統發育分析表明,白羊草內生真菌與來自羽茅的E.sibiria非常相似,支持率分別達99%和98%,與冰草屬禾草上的Epichlo? 菌株以及雀麥屬(Bromus)禾草上分離到的E.bromicola相似可能性較大,進化樹上自展率為94%。在通過actG基因序列得到的ML系統發育樹中,白羊草內生真菌與來自羽茅上的E.sibiria和E.gansuensis菌株相似性較高,支持率分別達99%和100%,但白羊草內生真菌的形態特征與羽茅中E.gansuensis不盡一致,具體表現為：從羽茅中分離純化的內生真菌在PDA培養基上生長速度快,并且菌落表面更加光滑和致密[11-12],而本研究中,白羊草內生真菌生長速度緩慢,并且與羽茅中E.sibiria內生真菌的特征描述相似。通過形態學和分子系統發育學分析,將白羊草內生真菌鑒定為Epichlo?sibiria。前期研究結果發現,不同恢復年限分離得到的白羊草內生真菌分別為赤霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬[13]以及Epichlo?屬。把白羊草內生真菌與已知吸附重金屬的內生真菌做系統進化樹分析,發現Epichlo?屬和白腐菌有較近的親緣關系,白腐菌對鎘有良好的吸附作用,白羊草能夠生活在鎘污染土壤的植物體內,可能由于Epichlo?sibiria對鎘也有吸附作用。分子鑒定結果揭示與白羊草共生的內生真菌特點,為今后研究白羊草-內生真菌共生體的生理生態特征提供科學基礎。

Vivas 等在鋅污染的土壤中篩選到抗100 mg/L Zn2+的短芽孢桿菌屬(Brevibacillus),羽茅內生真菌在Zn2+脅迫下的半致死濃度為80 mg/L[35],與已報道的細菌和內生真菌的重金屬抗性相比,本研究中白羊草內生真菌在120 mg/L的Zn2+脅迫處理下能繼續生長,說明白E.sibiria內生真菌自身對Zn2+具有較高抗性。Wu 等在鉛鋅尾礦土中篩選到對100 mg/L Cu2+和300 mg/L Pb2+都有較強抗性的固氮菌屬和芽孢桿菌,本試驗中銅尾礦壩白羊草E.sibiria內生真菌表現出對240 mg/L Pb2+和160 mg/L Cu2+都有一定抗性,這可能是由于植物內生真菌專性寄生于宿主體內,長期以來形成密切的共生關系,與細菌相比,真菌呈絲狀生長且生長快,生物量大,因而抗重金屬能力優于內生細菌[36]。已有研究發現,高羊茅內生真菌和羽茅內生真菌對Cd2+脅迫的耐受濃度分別為1 mg/L和5 mg/L[35],而白羊草內生真菌對Cd2+脅迫的耐受濃度為8 mg/L。本研究中分離純化得到的銅尾礦壩白羊草E.sibiria內生真菌,對重金屬Zn2+、Cu2+、Pb2+和Cd2+具有較高水平的抗性。這可能是內生真菌通過表面的吸附作用,或是菌絲分泌出多糖物質的結合作用使重金屬的毒性降低[37]。因此,白羊草內生真菌在多種重金屬污染的土壤修復過程中可能會有更大的適用性,特別是在銅礦區生態修復過程中,白羊草內生真菌可能對提高宿主抗性方面具有一定潛力。

4 結論

利用PDA培養基分離的方法,從白羊草中分離出的菌株菌落正面呈白色,背面淺黃色。菌落質地致密,形狀為中間突出。生長速度較慢,位于5.810—9.788 mm/周之間,孢子大小為1.208—8.048 μm之間,孢子形態橢圓、球型。通過進行actG、tefA和tubB擴增、測序和系統發育分析 將白羊草內生真菌鑒定為Epichlo?sibiria。銅尾礦壩白羊草E.sibiria內生真菌對重金屬Zn2+(120 mg/L)、Cu2+(160 mg/L)、Pb2+(240 mg/L)和Cd2+(8 mg/L)具有耐受性。