環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測生鮮果蔬中致病菌

王文博，苑學(xué)霞，鄔元娟，馮靜，劉磊，李瑞菊，李鴛鴦，張露月

(1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所/山東省食品質(zhì)量與安全檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院-北卡羅萊納州立大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品檢測技術(shù)和風(fēng)險(xiǎn)評估聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；3. 北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；4. 北京良潤生物科技有限公司，北京 102200；5. 煙臺市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 煙臺 264000)

作為全球性問題，食源性疾病廣泛威脅公眾安全，由果蔬攜帶致病微生物引發(fā)疾病的現(xiàn)象也呈逐年增加趨勢[1]。近幾十年來，許多發(fā)達(dá)國家對新鮮農(nóng)產(chǎn)品的需求日益增加[2]，然而，生食蔬菜特別是綠葉蔬菜可以傳播致病菌和病毒[3-5]，且被致病菌污染的果蔬很難通過常規(guī)方法清洗干凈[6]，因此引起了各國對即食果蔬是否含有致病菌的高度重視。

目前，傳統(tǒng)的檢測方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力且靈敏度低，不能滿足快速檢測需求[7. 8]，同時(shí)增加了企業(yè)的儲藏成本、質(zhì)量控制成本及政府對食品安全的監(jiān)管難度。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是日本學(xué)者Notomi等[9]于2000年開發(fā)的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，該技術(shù)特點(diǎn)是針對靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)2對特異引物，引物在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60～65℃恒溫?cái)U(kuò)增。LAMP快速檢測致病菌在臨床、醫(yī)藥等行業(yè)已被廣泛應(yīng)用，但應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品尤其即食蔬菜水果的相關(guān)研究報(bào)道較少。

本試驗(yàn)選取8種污染風(fēng)險(xiǎn)較高的即食生鮮果蔬為研究材料，利用 LAMP技術(shù)檢測其中沙門氏菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157、志賀氏菌和單增李斯特菌，并與國家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較，旨在為即食生鮮果蔬中致病菌的監(jiān)測提供一種快速、準(zhǔn)確的檢測手段，為生鮮果蔬行業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 蘋果、草莓、番茄、香菜、苦菊、葡萄、結(jié)球生菜和黃瓜(購自濟(jì)南七里堡蔬菜批發(fā)市場)。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 沙門氏菌(ATCC14028)、阪崎腸桿菌(P5)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸埃希氏菌O157(NCTC12900)、志賀氏菌(10130)和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(CMCC4002)，由北京良潤生物科技有限公司提供。

1.1.3 試劑 生理鹽水、致病菌(沙門氏菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157、志賀氏菌和單增李斯特菌)相應(yīng)的二次增菌液、腦浸液、無菌拭子、API試劑條、7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基、血平板、營養(yǎng)瓊脂、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基、葡萄球菌乳膠凝集試驗(yàn)試劑盒，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。聯(lián)合增菌液，由北京良潤生物科技有限公司提供。

1.1.4 試劑盒 沙門氏菌核酸LAMP檢測試劑盒、阪崎腸桿菌核酸LAMP檢測試劑盒、金黃色葡萄球菌核酸LAMP檢測試劑盒、大腸埃希氏菌O157核酸LAMP檢測試劑盒、志賀氏菌核酸LAMP檢測試劑盒、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌LAMP檢測試劑盒，均由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.5 儀器與設(shè)備 拍擊式均質(zhì)器，購自西班牙IUL公司；生化培養(yǎng)箱，購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；高壓滅菌鍋，購自山東省新華醫(yī)療器械股份有限公司；其它儀器有高速冷凍離心機(jī)；Mini離心機(jī)、金屬浴、超凈工作臺。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 準(zhǔn)確度及靈敏度試驗(yàn) 將8種蔬菜水果樣品去掉表面泥土，各稱量四份，每份稱量25 g，其中一份作為陰性對照，三份分別對應(yīng)加培養(yǎng)好的沙門氏菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌 O157、志賀氏菌和單增李斯特菌菌液的低(L)、中(M)、高(H)濃度(見表2)，然后加入225 mL聯(lián)合增菌液，36℃培養(yǎng)18～24 h。同時(shí)采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行檢測[10-15]。

取過夜培養(yǎng)的菌液1 mL加到1.5 mL無菌離心管中，14 000 r/min離心2 min，吸棄上清液，加入80 μL DNA提取液，混勻后95℃孵育10 min；14 000 r/min離心2 min，上清液即為核酸模板；將上清液移至另一潔凈1.5 mL無菌離心管于-20℃保存。

加入22.5 μL復(fù)溶液于反應(yīng)管中，然后加30 μL石蠟油，最后按順序分別加入陰性對照、待測模板、陽性對照各2.5 μL；利用Mini離心機(jī)瞬時(shí)離心，剪取相應(yīng)數(shù)量顯色管蓋，蓋緊，并置于金屬浴中65℃恒溫反應(yīng)60 min。

反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)管顛倒約停留5 s，使反應(yīng)液與顯色液(顯色液在蓋中)充分混合，觀察結(jié)果。在陰性對照反應(yīng)管呈橙色、陽性對照反應(yīng)管呈綠色前提下，若待檢樣本反應(yīng)管呈綠色，則可報(bào)告為檢測對象陽性；若待檢樣本反應(yīng)管呈橙色，則可報(bào)告為檢測對象陰性。

1.2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一污染的蔬菜，分別用3個(gè)批次試劑盒重復(fù)檢測3次， 記錄檢測結(jié)果。

1.2.3 特異性試驗(yàn) 取蔬菜樣品 6 份，分別加入培養(yǎng)的沙門氏菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌O157、志賀氏菌、單增李斯特菌懸液，混勻后取樣增菌，每個(gè)樣品用6種核酸 LAMP檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

對于生鮮果蔬中6種致病菌，核酸 LAMP方法和國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果一致，陽性結(jié)果和陰性結(jié)果符合率為100%(表1)。

表1 核酸 LAMP 方法和國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法比較

注： P：蘋果；C：草莓；F：番茄；X：香菜；K：苦菊；G：葡萄；S：生菜；H：黃瓜；H、M、L分別為高、中、低三個(gè)濃度；CK為只添加聯(lián)合培養(yǎng)液。未添加菌液的陰性對照；供試菌株L和G分別代表LAMP方法和國標(biāo)方法。

2.2 靈敏度試驗(yàn)

添加致病菌不同菌落數(shù)，LAMP方法檢測結(jié)果均為陽性(表2)，因此 LAMP 方法檢測金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌、大腸埃希氏菌 O157、志賀氏菌、單增李斯特菌的靈敏度均為 5 CFU/g。

表2 LAMP 方法靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

對生鮮果蔬中6種致病菌進(jìn)行檢測，核酸 LAMP 檢測試劑盒 3 個(gè)批次的檢測結(jié)果均為陽性，結(jié)果一致(表3)。

表3 不同批次LAMP檢測試劑盒重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 特異性試驗(yàn)

金黃色葡萄球菌 LAMP 方法只檢測金黃色葡萄球菌為陽性，與其他供試致病菌無交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)(表4)。其他5種菌的LAMP方法也是如此。

表4 LAMP 方法特異性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)2013年報(bào)告顯示，美國1998—2008年爆發(fā)的273120 次食源性疾病事件中71%與食源性致病微生物相關(guān)[1]。而導(dǎo)致染病并發(fā)病的相關(guān)食品中葉類蔬菜和水果/堅(jiān)果分別達(dá)到13%和11%，其中諾瓦克病毒常見于葉類蔬菜，水果和根莖類蔬菜上的沙門氏菌以及牛肉和葉菜類蔬菜上的大腸桿菌導(dǎo)致最高的染病住院率；水果上的沙門氏菌及葉菜類蔬菜上的大腸桿菌均具有最高的致死率[16, 17]。對食源性致病微生物及時(shí)檢測與鑒定，是降低危害的有力措施之一。傳統(tǒng)的致病微生物檢測鑒定方法耗時(shí)、繁瑣，已不能滿足快速檢測的需求。

LAMP 檢測方法只需恒溫就能完成擴(kuò)增反應(yīng)，快速、高效、耗時(shí)短。張?jiān)＞萚18]建立了苜蓿疫霉根腐病菌LAMP檢測方法，其可在恒溫條件下40 min完成擴(kuò)增，檢出0.1 ng苜蓿疫霉根腐病菌基因組DNA的存在。此外，LAMP檢測方法靈敏度較高，檢測牛肉中大腸桿菌O157的靈敏度為9.8 CFU/mL，人工污染牛肉的檢出限為68 CFU/g；而PCR檢測牛肉中大腸桿菌O157的靈敏度為980 CFU/mL，人工污染牛肉的檢出限為6.8×103CFU/g[19]。本試驗(yàn)中，LAMP 方法檢測沙門氏菌、阪崎腸桿菌等致病菌的靈敏度為5 CFU/g，且與國標(biāo)檢測結(jié)果一致，準(zhǔn)確度較高。

此外，LAMP檢測方法因其簡便、快速、高特異且不需要特殊試劑和儀器設(shè)備等優(yōu)勢，在多個(gè)行業(yè)均得到廣泛應(yīng)用。其中，LAMP檢測方法在檢測水果蔬菜方面也已得到應(yīng)用[1]，但多用于果蔬中病毒的檢測[20-22]，如朱林慧[23]建立了用于檢測進(jìn)境水果與種苗中冬生疫霉、下香疫霉和栗黑水疫霉的LAMP方法，其靈敏度遠(yuǎn)高出常規(guī)PCR與多重實(shí)時(shí)熒光PCR。關(guān)于食源性致病菌的檢測報(bào)道較少，張?bào)w銀等[24]應(yīng)用LAMP方法對10個(gè)蔬菜樣品中單增李斯特菌進(jìn)行了檢測。本試驗(yàn)對于生鮮蔬菜中6種致病菌的檢測結(jié)果證明，LAMP檢測方法重復(fù)性好且特異性高。

綜上所述，生鮮果蔬中6 種致病菌 LAMP 檢測方法具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、快速等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于果蔬中致病菌的快速檢測，為生鮮果蔬行業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支持。